[發(fā)明專利]表達(dá)傳染性支氣管炎病毒S1蛋白的重組新城疫疫苗株rAI4-S1及其構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310465927.8
• 申請日: 2013-10-08
• 公開（公告）號: CN103468651A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉秀梵;陳堅;屠頡;王曉泉;胡順林
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/50;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，拯救一株以新城疫病毒為載體表達(dá)傳染性支氣管炎病毒S1蛋白的重組疫苗株rAI4-S1，用于研制疫苗。

背景技術(shù)

反向遺傳操作技術(shù)（Reverse?genetics?manipulation?technique）:對于RNA病毒而言，反向遺傳技術(shù)是指在體外通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項研究技術(shù)，也叫全長感染性cDNA克隆技術(shù)，又常被稱為“病毒拯救”。[Neumann?G,Whitt?M?A,Kawaoka?Y,et?al.(2002).A?decade?after?the?generation?of?a?negative-sense?RNA?virus?from?cloned?cDNA–what?have?we?learned?J?Gen?Virol.83(11):2635-2662.]。新城疫病毒反向遺傳技術(shù)是在參照其它單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒（NNSV）的反向遺傳學(xué)操作技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。1999年P(guān)eeters等[Peeters?BPH,Olays,oe?Leeuw,Koch?G,et?al.(1999).Rescue?of?Newcastle?disease?virus?from?cloned?cDNA:Evidence?that?cleavability?of?the?fusion?protein?is?a?major?determinant?for?virulence.J?Virol.73:5001-5009.]和Romer-Oberdorfer等[Radecke?F,Spielhofer?P,Schneider?H,et?al.(1995).Rescue?of?meales?virus?from?cloned?DNA.EMBO?J14:5773-5784.]幾乎同時首次報道了新城疫病毒的成功拯救。

新城疫（Newcastle?disease），又稱亞洲雞瘟、偽雞瘟等。是由新城疫病毒引起的，主要感染雞、鴿、鵪鶉、火雞等家禽和野生禽類的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。可感染240種以上的禽類，世界各國都十分重視該病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為動物法定必報傳染病。新城疫病毒（Newcastle?disease?virus,NDV）是單股、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬成員。按照標(biāo)準(zhǔn)的致病性指標(biāo)可以將病毒分為速發(fā)型（強(qiáng)毒）、中發(fā)型（中等毒力）和緩發(fā)型（弱毒）。基因組長度大約15kb，其結(jié)構(gòu)為3’-leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（Nucleocapsid?protein,NP）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）、基質(zhì)蛋白（Matrix?protein,M）、融合蛋白（Fusion?protein,F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase?protein，HN）和大分子蛋白（Large?protein,L）。其中F蛋白具有誘導(dǎo)細(xì)胞融合、破壞細(xì)胞的作用，F(xiàn)蛋白是不同NDV毒性強(qiáng)弱的主要原因，并且F蛋白的裂解位點起到了重要作用。[Peeters?BP,et?al.Rescue?of?Newcastle?disease?virus?from?cloned?cDNA:evidence?that?cleavability?of?the?fusion?protein?is?a?major?determinant?for?virulence.Journal?of?Virology,1999.73（6）:p5001-9.]。

雞傳染性支氣管炎(Infectious?bronchitis，IB)是由病毒引起的雞急性、高度接觸性傳染性的呼吸道等疾病，其特征為病雞咳嗽、噴嚏，發(fā)出氣管啰音，在雛雞還可以出現(xiàn)流涕，產(chǎn)蛋雞出現(xiàn)產(chǎn)蛋減少和質(zhì)量變質(zhì)的現(xiàn)象，造成養(yǎng)禽巨大的經(jīng)濟(jì)損失[殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].第2版.北京:科學(xué)出版社,1997,675-680.]。S蛋白對IBV侵染性起著重要作用，當(dāng)病毒粒子啟動對敏感細(xì)胞感染時，首先是IBV毒粒囊膜的S蛋白與敏感細(xì)胞的受體相結(jié)合，通過病毒囊膜和細(xì)胞膜的融合或內(nèi)吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。