[發明專利]仔豬大腸桿菌K88、K99、987P纖毛抗原的高表達生產工藝及其提取方法

有效

• 申請號: 201310465436.3
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103509838A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 熊媛媛;蔣玉文;漆世華;田永祥;謝紅玲;劉澤文;黃濤;鄭佳;朱薇;溫文生;馮釗
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司;中國獸醫藥品監察所;湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/245;C07K1/14;A61K39/108;A61P31/04;A61P1/12;C12R1/19
• 代理公司: 北京慶峰財智知識產權代理事務所(普通合伙) 11417
• 代理人: 劉元霞

技術領域

本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及大腸桿菌纖毛抗原的生產工藝及其提取方法。

背景技術

產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic?Escherichia?coli,ETEC）是引起幼齡家畜腹瀉的主要病因之一（Vu?Khac?H,Holoda?E,Pilipcinec?E,et?a1.Serotypes,virulence?genes,and?PFGE?profiles?of?Escherichia?coli?isolated?from?pigs?with?postweaning?diarrhoea?in?Slovakia[J].BMC?Vet?Res.2006,2:10），而其致病作用與黏附性纖毛和腸毒素密切相關。ETEC菌株是通過細菌的纖毛與宿主小腸上皮細胞表面的相應受體結合，從而在該局部組織黏附、定居、繁殖和產生毒素，導致腹瀉（Jeyasingham?M?D,Butty?P,King?T?P,et?a1.Escherichia?coli?K88receptor?expression?in?intestine?of?disease-susceptible?weaned?pigs[J].Veterinary?Micmbiology.1999,68(3-4):219-234）。引起仔豬腹瀉的纖毛抗原主要是K88、K99、987P和F41（Fairbrother?J?M,汪銘書.從腹瀉病新生仔豬分離的非傳統血清型Ecoli的纖毛抗原和腸毒素檢測[J].國外獸醫學—畜禽傳染病,1989,9(3):26-28）。

纖毛抗原具有良好的免疫原性，免疫機體后能產生相應的纖毛抗體，對產腸毒素大腸桿菌具有免疫作用。由于幼畜起病早、發病快，利用纖毛抗原免疫懷孕母豬，產生特異性纖毛抗體，仔豬可通過被動免疫途徑獲得保護。

研制有效的纖毛抗原疫苗最重要的是獲得大量表達纖毛抗原的產腸毒素大腸桿菌，并將纖毛抗原從菌體上提取出來。巫月生等（巫月生，齊冬梅，張毓金等，豬K88、K99、987P、F41埃希氏大腸桿菌高密度發酵培養技術的初步探討，《中國獸醫雜志》，2011年，45（5）:8-10）采用高密度發酵培養，用反向間接血凝試驗測定纖毛抗原的效價，可達到2¹¹-2¹³。常采用的大腸桿菌菌毛提取的方法有4℃萬能混合器混合法，60-65℃水浴振蕩法，4℃組織搗碎法，冰浴勻漿法，4℃高速攪拌法。

纖毛抗原的表達除與菌株、培養基組成等有關外，培養方法亦至關重要。因此，研究高效表達纖毛抗原的產腸毒素大腸桿菌的生產工藝具有十分重要的現實意義。

發明內容

大腸桿菌在發酵過程中，碳源和氮源是決定發酵效果的關鍵因素，大腸桿菌對碳源和氮源的需求是變化的而不是一成不變的，在發酵過程的菌體生長階段，隨著菌體濃度的增長，菌體所需的碳氮比呈現越來越高的趨勢。因此，在基礎培養基的基礎上，根據發酵不同時期，通過補料實時調控碳源、氮源平衡，進行大腸桿菌高密度發酵培養，同時獲得高表達量的纖毛抗原，是研究的核心內容。

本發明的目的之一，篩選合適的氮源用于補料，獲得高表達纖毛抗原的大腸桿菌培養物。

為了實現上述目的，通過不同的氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨）進行篩選，最后確定優選為胰蛋白胨。

本發明的另一目的是，對碳源（葡萄糖）和氮源之間的添加量的最佳實施方案進行了摸索。

培養過程中，以初始培養基體積計，大腸桿菌C83549、C83644、C83710補充葡萄糖8-30g/L，優選為12-25g/L，補充胰蛋白胨8-20g/L，優選為10-16g/L。

本發明的另一目的在于提供一種高效表達仔豬大腸桿菌K88、K99、987P纖毛抗原的生產工藝，包括下述步驟：按照發酵罐體積70%加入改良Minca湯培養基，以培養基體積計，加入0.1%（v/v）的消泡劑，高壓滅菌后，待培養基溫度降至35-37℃，再按1%-5%（v/v）的接種量加入產纖毛抗原的大腸桿菌種子培養物，培養溫度37℃，攪拌速度300-450r/min，通氣量為6-9L/min，培養過程中自動補加氨水，使菌液pH值維持7.2左右，控制溶氧20%以上，以初始培養基體積計，補充葡萄糖和胰蛋白胨分別為8-30g/L、8-20g/L，培養6-9h制備大腸桿菌菌液。