[發(fā)明專利]分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310464090.5
• 申請(qǐng)日: 2013-10-08
• 公開（公告）號(hào): CN103525761A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江小霞;毛寧;楊燕美;李紅;黨瑞杰;張雷;李萍;劉元林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stem?cell，MSC）是骨髓中除造血干細(xì)胞外另一重要的干細(xì)胞。MSC具有自我更新、多向分化、免疫調(diào)控和支持造血的能力，而且來源廣泛，容易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示了良好的治療效果。雖然MSC臨床應(yīng)用廣泛，但許多關(guān)鍵問題如免疫調(diào)控的具體機(jī)制等并未解決。小鼠是重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，廣泛用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。在體外成功分離培養(yǎng)MSC，并得到大量純化的MSC是研究其分化及功能調(diào)控機(jī)制的前提。MSC主要來源于骨髓，但在骨髓中，MSC的含量很少，每10⁴-10⁵個(gè)單核細(xì)胞大約含1個(gè)MSC（Morikawa?S,Mabuchi?Y,Kubota?Y,et?al.Prospective?identification,isolation,and?systemic?transplantation?of?multipotent?mesenchymal?stem?cells?in?murine?bone?marrow.J?Exp?Med.2009.206.2483-2496）。目前分離小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓貼壁法、骨片消化法、流式或磁珠分選法等。全骨髓貼壁法即根據(jù)MSC的貼壁性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化MSC的目的（Soleimani,M.,&Nadri,S.A?protocol?for?isolation?and?culture?of?mesenchymal?stem?cells?from?mouse?bone?marrow.Nat.Protoc.2009.4.102-106；Sun?S,Guo?Z,Xiao?X,et?al.Isolation?of?mouse?marrow?mesenchymal?progenitors?by?a?novel?and?reliable?method.Stem?Cells.2003.21.527-535）。然而該方法獲得的MSC往往含有較多基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞污染。骨片消化法，是先將骨髓沖干凈，將股骨和脛骨剪碎，然后進(jìn)行膠原酶消化（Zhu,H.,Guo,Z.K.,Jiang,X.X.,et?al..A?protocol?for?isolation?and?culture?of?mesenchymal?stem?cells?from?mouse?compact?bone.Nat.Protoc.2010.5.550-560；Guo,Z.Li,H.,Li,X.,et?al.In?vitro?characteristics?and?in?vivo?immunosuppressive?activity?of?compact?bone-derived?murine?mesenchymal?progenitor?cells.Stem?Cells2006.24.992-1000）。雖然該方法獲得的MSC純度較高，但是程序復(fù)雜，且不同鼠齡骨片膠原酶消化時(shí)間不同，不容易掌握。隨著對(duì)MSC表面抗原認(rèn)識(shí)的深入，有研究者利用免疫方法如流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法對(duì)其進(jìn)行分離純化（Houlihan,D.D.,Mabuchi,Y.,Morikawa,S.,et?al.Isolation?of?mouse?mesenchymal?stem?cells?on?the?basis?of?expression?of?Sca-1and?PDGFR-α.Nat.Protoc.2012.7.2103-2111；Baddoo?M,Hill?K,Wilkinson?R,et?al.Characterization?of?mesenchymal?stem?cells?isolated?from?murine?bone?marrow?by?negative?selection.J?Cell?Biochem.2003.89.1235-1249）。雖然這兩種方法可以得到純度較高的細(xì)胞，但分離過程對(duì)細(xì)胞的活性影響較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性。而且實(shí)驗(yàn)條件要求高，需要骨髓量大，加之耗費(fèi)較大和技術(shù)難度，在某種程度上限制了這兩種方法的廣泛應(yīng)用。因此需要建立一種從骨髓中分離培養(yǎng)MSC的高效方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種獲得高純度和高單位數(shù)量（每根長骨得到的MSC）分離培養(yǎng)動(dòng)物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法還具有MSC出現(xiàn)時(shí)間早、不需除去骨髓、不需消化、操作簡便和快捷的優(yōu)點(diǎn)。