[發明專利]一種多元肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質結合物的混合物及其制備方法

有效

• 申請號: 201310464075.0
• 申請日: 2013-10-08
• 公開（公告）號: CN103495161B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 李建平
• 申請（專利權）人: 江蘇康泰生物醫學技術有限公司
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61K39/09;A61K39/385;A61K39/39;A61P31/04;C12N15/31;C12N15/70;C07K14/195
• 代理公司: 常州金之壇知識產權代理事務所(普通合伙) 32317
• 代理人: 周祥生

本發明公開了一種多元肺炎球菌莢膜多糖?蛋白質結合物的混合物，包含13種肺炎球菌莢膜多糖?蛋白質的結合物和增強免疫的佐劑，每一種肺炎球菌莢膜多糖?蛋白質的結合物由對應的血清型肺炎球菌莢膜多糖通過共價鍵與同一種蛋白載體的結合，所述13種肺炎球菌莢膜多糖是從肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F細菌通過純化提取獲得，所述蛋白載體是由基因重組大腸桿菌表達獲得的白喉毒素突變體CRM197的A鏈。同時公開了其制備方法。與傳統細菌發酵全鏈白喉毒素突變體CRM197相比易純化，產量大，成本低，經實驗證明本發明所述混合物具有免疫原性，可用于臨床接種。

技術領域：

本發明涉及一種具有免疫原性的13種肺炎球菌莢膜多糖-蛋白質結合物的混合物及其制備方法。

背景技術：

肺炎球菌性疾病的主要受害者是兒童，尤其在發展中國家，每年有數百萬的兒童因患肺炎、腦膜炎死亡。目前，接種疫苗是保護兒童免受肺炎細菌侵襲的有效途徑之一。從化學結構上看，肺炎球菌擁有一個細胞表面莢膜多糖層，其功能是幫助病原體感染宿主。莢膜多糖能夠屏蔽細菌細胞表面功能成分免于被宿主免疫系統識別，防止補體系統被細菌表面蛋白激活和免疫細胞吞噬，如果細菌被吞噬，莢膜多糖能夠防止細菌被殺滅。不同肺炎球菌菌株中具有不同化學結構的莢膜多糖，產生多種不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎或腦膜炎是由已知的90種血清型中的很大一部分菌株感染所導致的。如果用單一血清型肺炎球菌莢膜多糖來制備疫苗以預防肺炎球菌感染，效果有限；因此，要想提高預防效果，疫苗中應該包含有多種不同血清型的肺炎球菌莢膜多糖。臨床使用結果證明，用多種肺炎球菌莢膜多糖混合物制作的疫苗預防效果顯著。但該類疫苗還存在如下缺陷：第一，具有重復化學結構的多糖是T細胞獨立型2類的免疫原，沒有T細胞的參與，它們是無法誘導免疫記憶效應，刺激機體產生IgM和IgG2抗體，這些抗體在體內存留時間短，不能有效地保護機體免受細菌的侵襲；第二，這類疫苗不能夠誘導年齡小于2歲的嬰幼兒產生免疫應答來預防疾病，而這一人群正是免疫系統發育不完善，容易患傳染病的高危人群。

目前，人們已開始將多糖抗原與蛋白載體結合制備新型疫苗，以提高多糖的免疫原性。如John Robbins通過將流行性嗜血桿菌b型（Haemophilus influenzae type b，Hib）莢膜多糖（Polyribosylribitolphosphate,PRP）共價鍵連接到蛋白載體（破傷風類毒素）來制備流行性嗜血桿菌b型多糖PRP-破傷風類毒素結合疫苗（PRP-TT）。當細菌多糖以共價鍵的形式連接到蛋白載體，由于蛋白質是一種T細胞依賴性抗原，能夠將共價鍵連接的多糖轉變成T細胞依賴性抗原，從而刺激機體產生針對于該多糖的特異性IgG抗體，保護機體不受細菌的感染。但由于肺炎球菌導致的肺炎或腦膜炎可由多種不同的血清型或菌株感染所致，并且各血清型或菌株間由于細菌表面多糖的化學結構的不同，其抗體沒有交叉免疫反應，所以接種單一的血清型或菌株結合疫苗，無法保護被接種人體免于其它血清型或菌株的感染。因此，多價肺炎球菌多糖-蛋白結合疫苗是今后的重點研究方向，美國輝瑞公司已成功開發出13價肺炎球菌多糖-CRM197結合疫苗，以用于兒童預防肺炎和腦膜炎，但是這種疫苗所用的載體蛋白CRM197是通過發酵培養白喉桿菌變異株野株，從其發酵液中進行純化獲得，這種方法來制備CRM197生產周期長，產量低，生產成本高，造成該疫苗產品成本高昂，無法大批量生產，普通民眾無法接受高昂的價格；因此，無法廣泛的推廣應用。

白喉毒素突變體CRM197和白喉毒素結構相似，含有A鏈和B鏈。由于CRM197的A鏈的第52氨基酸發生的突變，由甘氨酸變成了谷氨酸，而變成了無毒毒素。因此，白喉毒素突變體CRM197被輝瑞公司用于開發多糖-蛋白結合疫苗的蛋白載體，從藥物的角度來看，其優點是安全，無毒；和其它蛋白載體，如破傷風類毒素、白喉類毒素相比較，CRM197作為蛋白載體的優點是該蛋白的表面具有穩定數量的氨基，而氨基是還原胺法合成結合物時，蛋白載體和多糖結合的位點。而類毒素由于經過甲醛去毒處理，分子表面的氨基數量變異較大。建立穩定的多糖和蛋白質結合的合成條件需要載體蛋白具有穩定的氨基數量。