[發明專利]檢測S100A11的納米磁珠分選-時間分辨免疫熒光試劑盒

無效

• 申請號: 201310462415.6
• 申請日: 2013-10-08
• 公開（公告）號: CN104515856A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 倪潤洲
• 申請（專利權）人: 倪潤洲
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.檢測S100A11的納米磁珠分選-時間分辨免疫熒光試劑盒，其特征在于包括以下組成：

（1）30nm粒徑的超順磁性復合微粒；

（2）偶聯緩沖液；

（3）磷酸鹽緩沖液（PBS），其成分為140mM?NaCl，2.7mM?KCl，?10mM?Na₂HPO₄，1.8mM?KH₂PO₄，pH值為7.4；

（4）封閉液為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；

（5）洗滌液為含0.05%Tween-20的Tris-HCl?緩沖液（TBS），其成分為50mM的Tris-HCl?緩沖液（pH?7.8），0.05%Tween-20；

（6）加樣緩沖液的成分為含1%BSA的PBS，其成分為PBS，1%BSA；

（7）熒光增強液（Enhancement?Solution）；

（8）檢測緩沖液（Assay?Buffer）為50mM的Tris-HCl?緩沖液（pH?7.8），其中含有1%BSA，1%bovine?globulin，0.05%Tween?40，DTPA；?

（9）包被抗體為單克隆小鼠抗人S100A11抗體（Monoclonal?Anti-Human?S100A11?Antibody），儲存濃度為1μg/μl；

（10）檢測抗體為生物素化的羊抗人S100A11多抗（Biotinylated?Anti-Human?S100A11?Antibody），儲存濃度為50ng/μl；

（11）Eu^3＋標記的鏈親和霉素（Eu^3＋-labeled?streptavidin），儲存濃度為0.1μg/μl；

（12）標準品，重組人S100A11蛋白（Recombinant?Human?S100A11），濃度為100μg/μl。

?2.?如權利要求1所述檢測S100A11的納米磁珠分選-時間分辨免疫熒光試劑盒的使用方法，其特征在于以下步驟：

（1）用1ml偶聯液溶解500μg單克隆小鼠抗人S100A11抗體，加入30nm粒徑的超順磁性復合微粒，輕搖混勻，置于恒溫搖床，37℃、180?rpm?振蕩反應20min，反應完畢，磁性分離2?min；?

（2）在上述離心管中加入1?ml?洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，重復該清洗操作1次；

（3）在離心管中加入3?ml封閉液，置于恒溫搖床，37℃、180?rpm?振蕩反應2?h，磁性分離，棄上清；

（4）在離心管中加入1?ml?洗滌液，輕搖混勻，磁性分離，棄上清，重復該清洗操作3次；

（5）在500μl待測培養上清樣品和倍比稀釋的標準品中加入納米磁珠偶聯的抗體2μl，混合均勻，置于37℃搖床180rpm，1h；

（6）將上述1.5ml?Ep管置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后將500ul血清全部取出后凍存；

（7）將上述1.5ml?Ep管置于磁性分離器上，用500μl?PBS-0.05%Tween20洗滌三次；

（8）加入稀釋好的檢測抗體Biotinylated?Anti-Human?S100A11?Antibody（Detect?Antibody）100μl/管，混合均勻，置于37℃搖床180rpm，1h；

（9）將上述1.5ml?Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去檢測抗體，用500μl?Wash?Buffer洗滌三次；

（10）加入用Assay?Buffer?配制的Eu-labeled?streptavidin?100μl/孔，混合均勻，置于37℃搖床180rpm，避光，1h；

（11）將上述1.5ml?Ep管重新置于磁性分離器上，磁性分離2min，然后棄去Eu-labeled?streptavidin，500μl/孔Wash?Buffer洗滌四次；?

（12）加入Enhancement?Solution?200μl/孔，混合均勻后，將200μl液體加于96孔檢測板中，室溫避光孵育45min并Slowly?Shaking?5min；

（13）?讀板：設定激發光波長（Excitation?wavelength）為337nm，發射光波長（Emission?wavelength）為615nm，延時200微秒測定615nm處的熒光值；

（14）利用統計學繪圖軟件根據測定的值繪制標準曲線；

（15）通過標準曲線和未知濃度樣品的熒光值計算待測樣品中的S100A11的濃度。