[發明專利]哺乳動物組織分離的線粒體質子漏測定儀和測定方法

無效

• 申請號: 201310462402.9
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103529109A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 徐瑜;柳君澤;劉煜亮;胡義德;錢桂生;王長征;王關嵩;郜攀
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: G01N27/416
• 分類號: G01N27/416
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 徐先祿

技術領域

本發明涉及生物能量學領域，具體涉及哺乳動物組織分離的線粒體質子漏測定儀和測定方法。

背景技術

線粒體是細胞能量工廠，合成ATP（三磷酸腺苷）供機體使用，與生命活動息息相關。線粒體能量合成影響因素涉及到電子傳遞、氧化磷酸化偶聯以及糖、脂肪、蛋白質等物質的代謝過程，是一個復雜而精妙的過程。線粒體呼吸鏈在傳遞電子的過程中消耗氧，同時將質子由線粒體內膜的基質側轉移到內膜外側形成跨膜質子梯度，即質子勢能(△P)，質子勢能驅動質子返回基質側并由ATP合成酶合成ATP。但有一部分質子不通過ATP酶而回到基質，勢能以熱能的形式釋放，不產生ATP，這個過程稱為質子漏（Brand?M?D,Chien?L?F,Ainscow?E?K,et?al.The?causes?and?functions?of?mitochondrial?proton?leak.Biochim?Biophys?Acta,1994,1187(1):132～139）。質子漏作為一個生理現象廣泛的存在于人體各個組織細胞的線粒體中（Porter?R?K,Brand?M?D.Body?mass?dependence?of?H+leak?in?mitochondria?and?its?relevance?to?metabolic?rate.Nature,1993,362(6421):628～630），隨著線粒體功能狀態改變而發生變化，并影響線粒體ATP合成。探測線粒體質子漏大小及其改變是研究線粒體功能的重要指標。

以往的研究多以Clark氧電極所測定線粒體呼吸氧耗曲線中的4態呼吸氧耗作為反映質子漏的指標。但這樣存在兩個問題：首先，呼吸氧耗的反應體系沒有加入寡霉素抑制ATP合成酶的活性,4態呼吸時,ATP合成酶仍然少量的合成與分解ATP，這時的耗氧量不能絕對代表質子漏途徑消耗的氧量；其次，線粒體內膜為非歐姆導性膜，內膜兩側電壓差△ψ增高到一定程度時，電子傳遞速度降低而質子回漏增加。可見質子漏的大小應該是一個動態變化的數值，而不應該由4態呼吸氧耗這樣一個靜態的指標表示。因此，需要尋求一種能實時準確反映線粒體質子漏大小的裝置和方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種哺乳動物組織分離的線粒體質子漏測定儀，其能夠準確地測定線粒體質子漏大小，為實驗研究不同狀態下線粒體功能提供數據。

本發明所述的哺乳動物組織分離的線粒體質子漏測定儀，包括設在基座上面的質子漏反應槽，在所述質子漏反應槽的上部設有外參比電極插入孔和TPMP^＋電極插入孔，在所述質子漏反應槽的底部設有Clark氧電極插入孔，其特征是：

一TPMP^＋電極的一端插入所述質子漏反應槽上部的TPMP^＋電極插入孔；

一外參比電極的一端插入所述質子漏反應槽上部的外參比電極插入孔；

一Clark氧電極的一端插入所述質子漏反應槽底部的Clark氧電極插入孔，Clark氧電極是為測定水中溶解氧含量而設計的一種極譜電極，能反映溶液中的氧含量；

所述TPMP^＋電極的另一端和所述外參比電極的另一端分別通過電極導線與pH/離子計電連接，該pH/離子計與計算機電連接；

所述Clark氧電極的另一端與氧電極信號轉換器電連接。

所述的哺乳動物組織分離的線粒體質子漏測定儀，其所述TPMP^＋電極包括聚氯乙烯套筒、設在聚氯乙烯套筒底部的TPMP^＋電極膜、下端插入聚氯乙烯套筒內的鉑絲，所述鉑絲的上端，即TPMP^＋電極的另一端，通過電極導線與pH/離子計電連接。

本發明還提供一種哺乳動物組織分離的線粒體質子漏的測定方法，該方法能實時準確反映線粒體質子漏大小，適用于生物器官組織分離線粒體質子漏的測量。

所述的哺乳動物組織分離的線粒體質子漏的測定方法，以哺乳動物組織分離的線粒體為測定對象，包括以下步驟：

第一步，制備組織勻漿液；

第二步，分離組織線粒體；

第三步，制備線粒體懸液；

第四步，測定質子漏，在所述哺乳動物組織分離的線粒體質子漏的測定儀上進行；

①測定TPMP^＋濃度，作標準滴定曲線；

②測定質子漏；

③測定線粒體外的TPMP⁺含量；

④繪制線粒體質子漏曲線圖。