[發明專利]一種偏甘油酯脂肪酶突變體、質粒、重組菌株及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310461452.5
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525784A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 藍東明;王永華;劉璐;王衛飛;楊博
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/64;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種甘油單酯水解活性提高的偏甘油酯脂肪酶突變體及其應用。?

背景技術

脂肪酶（EC3.1.1.3）即三酰基甘油酰基水解酶，能夠催化水解天然底物油脂生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。而偏甘油酯脂肪酶是一種只水解甘油單酯和甘油二酯，而不水解甘油三酯的脂肪酶。脂肪酶參與的催化反應類型廣泛，包括催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于飼料添加劑、油脂加工、食品行業、生物醫藥、日用化工等領域。?

甘油二酯(簡稱DAG)是由丙三醇（甘油）與兩個脂肪酸酯化后得到的產物，具有明確的防止肥胖、降血脂等功能且食用安全，作為普通食用油的換代產品。脂肪酶可以在溫和的條件下催化油脂改性制備甘油二酯，但現有的酶法合成甘油二酯合成工藝中一般含有甘油三酯和單甘油酯（MAG），由于甘油三酯與甘油二酯難以有效分離，使得產品中DAG的純度較低，專利02827094.0公開了一種利用利用偏甘油酯脂肪酶通過酯化方法合成高純度甘油二酯的方法，但其反應的副產物含有甘油單酯。雖然可以通過分子蒸餾等工藝將反應混合物中的MAG和未反應的酰基供體分離除去，但處理過程中高的蒸發溫度，一方面導致能耗提高，同時使影響油脂的產品的品質。利用特異性的甘油單酯脂肪酶用于降解油脂產品中的MAG可以在溫和的條件下獲得高純度的DAG，但是至今特異性甘油單酯脂肪酶酶制劑仍然缺乏。?

蛋白質工程是一種能夠改善酶蛋白質特性的可行的方法，借助分子生物學和生物信息學的方法對蛋白進行定向突變和理性改造，而獲得底物選擇性改變的酶突變體。?

發明內容

本發明解決的技術問題是提供一種選擇性水解甘油單酯水解的SMG1脂肪酶突變體，可應用于制備高純度的甘油二酯。通過理性選擇突變位點，是由馬拉色霉菌屬（Malassezia?globosa）SMG1脂肪酶基因（genbank登錄號XM_001732152.1），通過對其蛋白結構（PDB：3UUE）的分析，運用定點突變的方法而獲得的脂肪酶突變體。進行定點突變獲得酶突變體，親本SMG1-WT的氨基酸序列SEQ?ID?NO：1中在氨基酸取代位置發生突變，采用“原始氨基酸-位置-替換的氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸，所述脂肪酶突變體為：Phe278Arg。?

本發明的技術方案具體如下：?

一種偏甘油酯脂肪酶突變體，該突變體是對馬拉色霉菌（Malassezia?globosa）偏甘油酯脂肪酶進行定點突變獲得的酶突變體，其中突變位點為278位的Phe；所述Phe突變為Arg。?

所述突變體的DNA序列為SEQ?NO.2。?

所述突變體的氨基酸序列為SEQ?NO.3。?

所述偏甘油酯脂肪酶突變體在制備高純度甘油二酯中的應用，首先，利用上述突變體制備突變質粒，再制備重組菌株，最后利用重組菌株表達制備偏甘油酯脂肪酶突變體，并將偏甘油酯脂肪酶突變體用于制備高純度甘油二酯。?

所述利用上述突變體制備突變質粒的方法，包括如下步驟：?

（1）利用重疊延伸PCR方法引入目的突變氨基酸位點，先分段擴增含有突變氨基酸位點的上下游基因片段，然后將帶有突變位點的基因片段拼接成含有突變位點全長基因片段；?

（2）將上述擴增基因PCR產物經DNA純化后，限制性內切酶Kpn?I和Sal?I分別對純化的基因片段和質粒pGAPZαA進行雙酶切消化，連接，轉化至大腸桿菌E.coli?DH5α感受態細胞，得到含有偏甘油酯脂肪酶突變體基因質粒。?

所述PCR的引物序列如下：?

所述重組菌株的制備方法，包括如下步驟：?

（1）將上述質粒經限制性內切酶Bln?I線性化后，電轉至宿主細胞；?

（2）將轉化液涂布于含有100mg/ml博萊霉素的YPD平板中，30℃培養3天后，平板上長出酵母單菌落為重組菌株。?

所述宿主細胞為巴斯德畢赤酵母X-33。?

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：?