[發明專利]用于腫瘤組織細胞的染色劑組合物及其制備方法

有效

• 申請號: 201310461322.1
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103483872A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 李建忠;單虎
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C09B67/42
• 分類號: C09B67/42;C09B67/22;G01N1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種用于腫瘤組織細胞的染色劑組合物，特別涉及一種用于腫瘤細胞的基于顏色變化的染色劑組合物。本發明還涉及該組合物用于檢測腫瘤細胞的組合物以及其使用載體。?

技術背景

目前，針對腫瘤細胞的染色劑，世界通用的是姬氏、瑞氏兩種染料，它們是以酸堿化學物質經過加熱制成的混合物，容易因濕度等原因導致其比例失衡，另外，其對細胞染色不存在特異性。?

用于對組織腫瘤細胞進行活體染色的方法主要有基于乙酸白化反應、碘實驗、甲苯胺藍實驗、亞甲基藍實驗，其中亞甲基藍染色較為廣泛。乙酸白化反應時通過3-5%乙酸溶液，涂抹于組織細胞，等待一段時間后觀察組織細胞有無乙酸白化反應區。若有白化區，則該組織懷疑有腫瘤細胞。碘實驗的原理是糖原反應，該反應對腫瘤細胞染色的特異性較低。使用甲苯胺藍的方法易使中性白細胞和細菌的核碎片著色，容易導致假陽性，且其對腫瘤細胞不易著色。?

亞甲基藍是一種無毒性的生物染色材料，它的氧化型呈藍色，還原型為無色。其對癌細胞及黑色素有高度的親和性。在弱酸條件下，還原態的亞甲基藍可以被癌細胞中具有強氧化性的自由基氧化為亞甲基藍，呈藍色，可初步估計判斷是否含有癌細胞。有研究將其用于食道上皮組織細胞的定位活體取材，其具有提高活檢陽性率的作用。專利CN201110449270采用糖類還原劑，在酸性條件下，制備還原態亞甲基藍；利用還原態亞甲基藍的氧化變色特性和葉酸以及葉酸復合物組合使用；通過染色和顏色變化反應，快速定位和檢測上皮腫瘤細胞的檢測，取得了較好效果。我們研究發現，該實驗條件下，糖類是一種弱還原劑，很難實現對亞甲基藍的還原；采用弱堿性條件，制備還原態亞甲基藍，當加入酸性試劑，例如醋酸，還原態亞甲基藍會顯藍色，進而導致染色時顏色變化不穩定。?

發明內容

本發明的目的在于生產一種準確率高、操作簡便、特異性高的腫瘤細胞染色劑，對手術前組織細胞進行染色，利用顏色變化，加強腫瘤細胞與正常細胞的區別，指導病變區域的檢測。本發明涉及一種針對腫瘤細胞的染色劑，其對腫瘤細胞和正常細胞存在染色差異性。?

臨床研究證明，葉酸受體在大多數腫瘤細胞表面過度表達，而在正常細胞中的存在很少，所以葉酸可以作為腫瘤特異性靶向介導分子，用于腫瘤的診斷和治療。研究發現葉酸與亞甲基藍分子能夠形成葉酸亞甲基藍復合物。在酸性條件下，復合物能夠與腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體結合，進而容易進入腫瘤細胞。研究發現，盡管腫瘤組織的抗氧化能力比一般正常組織明顯增強，但仍存在明顯的氧化應激狀態。另外，腫瘤細胞的新陳代謝增強，其細胞中氧化還原平衡過程中傾向于氧化，除非腫瘤細胞處于死亡或抑制狀態。因此，在活細胞的胞內環境下，在腫瘤細胞的氧化應激態中，還原態亞甲基藍被迅速氧化，產生?顏色變化，亞甲基藍變為紫黑色。本發明的組合物中的還原態的亞甲基藍在腫瘤細胞中得到氧化，呈現出氧化態的綠色、藍綠色和紫黑色。?

本發明利用葉酸與腫瘤細胞過度表達的葉酸受體的相互作用，并結合顯色劑亞甲基藍和/或二氯酚靛酚在氧化還原中顏色的變化，能夠快速、準確對異常細胞進行染色，進而將其與正常細胞進行區分，并通過本發明組合物的顏色變化快速顯示顏色，判斷組織細胞是否為腫瘤細胞，由此提供了快速、準確、簡單的對異常組織細胞的定位與檢測。本發明染色劑組合物，對異常細胞敏感性高，能夠快速顯色；而對正常組織細胞，不顯色。本發明染色劑，操作簡便，檢查時間短。另外，亞甲基藍和/或二氯酚靛酚都作為臨床上廣泛使用的試劑，具有安全、有效、價格低廉并且容易獲得，抗壞血酸、葉酸等都是臨床廣泛應用的藥物，使本組合物安全、可靠、無毒副作用，從而使本方法利于推廣。?

本發明提供了一種腫瘤細胞染色劑組合物，所述組合物包含以下組分（按重量百分比計）：顯色劑，0.01-5%；葉酸≤6.5%；隱色劑，0.1-10%；pH調節劑≤10%；水，3-95%。?

本發明所述的用于腫瘤組織細胞的染色劑組合物的實施方案中，其顯色劑為亞甲基藍、二氯酚靛酚、二氯酚靛酚鈉之種或其組合物，其中其用量為0.01-5%，優選0.05-1.0%；腫瘤細胞靶向藥物為葉酸，其含量為0-6.5%，優選0-1.2%。?

本發明所述的用于腫瘤組織細胞的染色劑組合物的實施方案中，其隱色劑為還原性物質，包括抗壞血酸、鋅粉、辛酸亞錫之一種或多種，優選抗壞血酸。?

本發明所述的用于腫瘤組織細胞的染色劑組合物的實施方案中，其隱色劑用量為0.1-10%，優選2-3%。pH調節劑選用甲酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、丁二酸、酒石酸、硼酸之一種，優選為乙酸、乳酸優選3-6%。?