[發明專利]DNA片段及其在制備H5N1亞型流感Guassia熒光素酶報告病毒中的應用

有效

• 申請號: 201310461215.9
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN104513820B
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 戶義;祝慶余;李靖;吳曉燕;孫偉;韓鵬飛;楊銀輝;康曉平;李裕昌;張雨
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N7/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種DNA片段及其在制備H5N1亞型流感Guassia熒光素酶報告病毒中的應用。

背景技術

H5N1亞型流感病毒是甲型流感病毒的一種，主要在禽類傳播。近年來，H5N1亞型流感病毒感染人類的報道逐年增多，截至2012年8月，全球已有15個國家和地區報告608人感染，其中359人死亡，死亡率高達59%。感染滴度是病毒相關基礎研究以及藥物、疫苗研發所需的基礎數據。目前，H5N1亞型流感病毒的感染滴度主要依靠測定病毒的半數組織培養感染劑量（TCID50）或空斑形成單位（PFU）來確定，操作復雜且準確程度易受到主觀經驗影響。

Gaussia熒光素酶是新近發現的一種由海洋橈腳類動物產生的熒光素酶，具有分子量小、檢測靈敏度高、半衰期短等優點。由于Gaussia熒光素酶自身具有分泌肽,細胞中80%以上的酶分子能分泌至細胞外，可通過檢測細胞培養上清或血液中熒光素酶活性指示體內熒光素酶表達情況。例如，Thomas、Chung等成功通過測定血液中Gaussia熒光素酶活性定量評價了體內腫瘤生長過程；Griesenbach等利用支氣管肺泡灌洗液和血清中的Gaussia熒光素酶活性對陽離子脂質體GL67A的呼吸道載體投遞效果等進行了定量測定等。

目前，還沒有表達Gaussia熒光素酶的重組H5N1亞型流感報告病毒及其相關的應用研究。

發明內容

本發明的目的是提供一種DNA片段及其在制備H5N1亞型流感Guassia熒光素酶報告病毒中的應用。

本發明所提供的DNA片段，其核苷酸序列由如下序列依次串聯組成：首端限制性內切酶BsaⅠ的保護堿基及其識別位點、H5N1亞型流感病毒NA（神經氨酸酶）節段3’端非編碼區序列、H5N1亞型流感病毒NA基因序列（不含終止子）、豬捷申病毒（porcine teschovirus–1，PTV-1）2A肽編碼序列、Gaussia熒光素酶基因序列、H5N1亞型流感病毒NA基因3’端包裝信號、H5N1亞型流感病毒NA節段5’端非編碼區以及末端限制性內切酶BsaⅠ的識別位點及其保護堿基。

在上述DNA片段中，所述首端限制性內切酶BsaⅠ的保護堿基及其識別位點為序列表序列1的第1-14位；

所述H5N1亞型流感病毒NA節段3’端非編碼區序列為序列表序列1的第15-34位；

所述H5N1亞型流感病毒NA基因序列（不含終止子）為序列表序列1的第35-1381位；

所述PTV-1病毒2A肽編碼序列為序列表序列2的第16-81位；

所述Gaussia熒光素酶編碼基因序列為序列表序列2的第82-636位；

所述H5N1亞型流感病毒NA基因3’端包裝信號序列為序列表序列3的25-181位；

所述H5N1亞型流感病毒NA節段5’端非編碼區編碼基因序列為序列表序列3的第182-210位；

所述末端限制性內切酶BsaⅠ的保護堿基及其識別位點為序列表序列3的第211-225位

在上述DNA片段中，所述DNA片段的核苷酸序列為序列表序列4。

本發明保護含有上述DNA片段的重組載體、重組菌、重組細胞或重組病毒。

所述重組載體具體可通過在載體pHW2000的BsaI位點處插入上述DNA片段得到。

上述DNA片段、重組載體、重組菌、細胞在制備H5N1亞型流感Guassia熒光素酶報告病毒中的應用。

本發明還提供一種重組載體組合，由權利要求5所述重組載體、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB2、pHW2000-VN-PB1、pHW2000-VN-PA、pHW2000-VN-HA、pHW2000-VN-NP、pHW2000-VN-M、pHW2000-VN-NS組成；該重組載體組合可用于制備H5N1亞型流感Guassia熒光素酶報告病毒。