[發明專利]采用免疫磁納米粒子和SPR技術相結合檢測溴氰菊酯的方法

有效

• 申請號: 201310460621.3
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103472219A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 劉霞;李文進;李蕾;毛璐剛;楊陽
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/55
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術領域

本發明涉及農藥分析及生物傳感器技術領域，具體的是涉及一種利用免疫磁納米粒子檢測農產品中殘留的溴氰菊酯的SPR免疫傳感器方法。

背景技術

溴氰菊酯，是目前菊酯類殺蟲劑中毒力最高的一種。溴氰菊酯屬于中毒毒類，皮膚接觸可引起刺激癥狀，出現紅色丘疹。急性中毒時，輕者有頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、食欲不振、乏力，重者還可出現肌束顫抖和抽搐。目前溴氰菊酯殘留的檢測方法主要有氣相色譜、高效液相色譜、色譜/質譜聯用技術、酶聯免疫分析等。其中色譜分析法儀器設備貴重，樣品前處理復雜，需專業人員；而酶聯免疫分析方法相對復雜，靈敏度較低，耗時，成本較高，且均需要復雜的樣品前處理。與上述檢測方法相比，表面等離子共振（surface?plasmon?resonance，SPR）傳感技術是一種基于物質折射率變化的、可實時動態監測的現代檢測技術，具有快速、高靈敏、耗樣量少、無需標記、芯片可重復使用等特性，且操作簡單，但無法直接高靈敏地檢測溴氰菊酯農藥小分子。

農藥殘留分析是復雜混合物中痕量組分的分析技術，采用適當的農藥殘留提純方法是成功建立準確、快速、高靈敏農藥殘留檢測技術的關鍵。近年來發展的磁性納米材料是一種新型的親和性固相載體，在外加磁場下具有可控運動的特點，所需設備簡單，操作柔和。將磁納米粒子與各種分析方法相結合應用于檢測，可以在復雜的體系中快速富集待檢物，得到濃縮、純凈的樣品，有助于縮短檢測時間及檢測的準確度。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，針對現有SPR傳感器無法實現直接高靈敏檢測溴氰菊酯農藥小分子，以及農產品樣品前處理復雜的問題，提供一種采用免疫磁納米粒子和SPR技術相結合檢測溴氰菊酯的方法。該方法不僅將樣品前處理和檢測技術相結合，提高了方法的靈敏度和準確性，且操作簡單，檢測快速、選擇性高、重現性和再生性好，回收率符合要求，可直接對農產品中溴氰菊酯殘留進行檢測，具有重要的實際應用價值。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種采用免疫磁納米粒子和SPR技術相結合檢測溴氰菊酯的方法，該方法是將免疫磁納米粒子加入到含溴氰菊酯的待測樣品溶液中，使免疫磁納米粒子與溴氰菊酯發生特異性結合，經外加磁場分離后得到結合物，將該結合物直接注入經殼聚糖修飾的SPR芯片表面，以檢測出待測樣品溶液中的溴氰菊酯含量。

上述檢測溴氰菊酯的過程詳述如下，請結合參見圖1：

1、磁納米粒子的制備和表征：取0.5g富里酸加入60mL純水并置于圓底燒瓶中，通入氮氣除氧的同時并用恒溫磁力攪拌器200r/min攪拌加熱至沸騰，沸騰后立即加入5mL含有0.6g?NaOH、1.08g?FeCl₃·6H₂O和0.6g?FeSO₄·7H₂O的混合溶液，回流2h。待溶液冷卻至室溫后，經磁性分離，多次純水洗滌至中性，分別采用紫外光譜、傅里葉紅外光譜和透射電子顯微鏡表征，結合參見圖2。

上述羧基化磁納米粒子的制備方法為現有技術，可參考已報道的表面羧基化磁納米粒子的合成方法[Chunjiao?Zhou?et?al,Fulvic?acid?coated?iron?oxide?nanoparticles?for?magnetic?resonance?imaging?contrast?agent,Funct.Mater.Lett.03(2010)197-200頁]。

2、免疫磁納米粒子的制備：取200μL1.9-3.8mM的羧基化磁納米粒子溶液，加入400μL的EDC/NHS（0.4M/0.1M）混和液，漩渦震蕩5-10min，冰浴超聲5-10min后，加入200μL0.27-0.55mg/mL溴氰菊酯單克隆抗體溶液，漩渦震蕩5-10min，冰浴超聲5-10min后，加入0.1M乙醇胺200μL，漩渦震蕩5-10min，靜置15-20min后，經外加磁場分離后，用PBS緩沖液(10mM、pH7.4)清洗并定容至200μL，置于4℃冰箱中保存備用，分別采用紫外光譜、傅里葉紅外光譜和透射電子顯微鏡進行表征，結合參見圖2。

上述0.27-0.55mg/mL的溴氰菊酯單克隆抗體溶液是取3.3mg溴氰菊酯單克隆抗體（購買于武漢三鷹生物技術有限公司）加入1ml?PBS緩沖液(10mM、pH7.4)配制成3.3mg/mL的母液，再用PBS緩沖液(10mM、pH7.4)稀釋而成。