[發(fā)明專利]一種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310460112.0
• 申請(qǐng)日: 2013-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN103471898A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡繁;葛夢(mèng)夢(mèng);汪惠麗;王艷;劉志華;徐麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 合肥工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/30
• 分類號(hào): G01N1/30
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 汪祥虬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于神經(jīng)病理學(xué)組織染色法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)組織染色的方法。

背景技術(shù)

已有的科學(xué)研究表明，大腦神經(jīng)系統(tǒng)有一類專門負(fù)責(zé)傳遞和處理神經(jīng)信號(hào)的興奮性細(xì)胞---有棘神經(jīng)元，主要是由于神經(jīng)元樹突上分布的形態(tài)各異的小突起---樹突棘而得名。神經(jīng)元的樹突樹的精細(xì)構(gòu)筑調(diào)控了神經(jīng)元之間復(fù)雜的突觸連接，并依此來調(diào)節(jié)神經(jīng)信號(hào)的傳遞。樹突棘是神經(jīng)元上突觸輸入的重要靶點(diǎn)，它與突觸可塑性有直接的相關(guān)性。因此觀察有棘神經(jīng)元的樹突結(jié)構(gòu)的改變對(duì)解釋大腦復(fù)雜的功能基礎(chǔ)和神經(jīng)疾病的病變機(jī)理提供了直接證據(jù)。

在組織學(xué)染色領(lǐng)域，高爾基銀染法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種觀察神經(jīng)元形態(tài)的染色方法，可以用來分析神經(jīng)元的樹突結(jié)構(gòu)和樹突棘形態(tài)。因其操作方便，耗費(fèi)小，染色效果好，對(duì)顯微鏡要求低，并且該方法的組織切片在200微米左右可以清晰的顯示整個(gè)神經(jīng)元樹突的形態(tài)。它的傳統(tǒng)操作流程是在染色液配置好后，將一定大小的腦組織放置其中，室溫避光保存，兩天后需要換置新鮮的染色液，14天后取出腦組織進(jìn)行切片、顯影和觀察。但是該方法目前還存在一系列問題，比如整個(gè)過程費(fèi)時(shí)、切片容易成碎片、染色時(shí)容易掉片等等。特別是由于浸染時(shí)間需要14天，大大影響了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。目前有很多研究組對(duì)該染色方法進(jìn)行了一些改進(jìn)來避免上述問題，比如替換顯影液，氧化劑等，但是實(shí)驗(yàn)時(shí)間最短也要5天，也有相關(guān)報(bào)道將浸染溫度改為37℃，但是因?yàn)榻緯r(shí)間的問題，染色效果不如原始方法的好。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，以實(shí)現(xiàn)快速觀察在體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從而能夠?yàn)榕R床病例分析神經(jīng)系統(tǒng)的病變以及神經(jīng)學(xué)的基礎(chǔ)研究提供便捷的手段。

本發(fā)明基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，其特征在于包括以下步驟：

先以質(zhì)量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1:1:1的比例配制成高爾基銀染溶液；

將待神經(jīng)元染色的腦組織浸沒在上述配制的銀染溶液中，在37±2℃環(huán)境溫度下浸泡36到48小時(shí)；

然后利用振動(dòng)切片機(jī)將浸泡好的腦組織進(jìn)行切片，并置于明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個(gè)載玻片，放置過夜；

將上述放置過夜的切片經(jīng)過氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。

所述將浸泡好的腦組織進(jìn)行切片的步驟為：取出浸泡好的腦組織，用磷酸緩沖液沖洗，然后將振動(dòng)切片機(jī)的有關(guān)參數(shù)設(shè)定為：振幅0.45毫米，切片前進(jìn)速度0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，采用振動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片。

由于本發(fā)明采用了在將組織浸泡的溫度從傳統(tǒng)高爾基染法采用的室溫提高至37±2℃的同時(shí)將浸泡時(shí)間控制在36到48小時(shí)之間，從而在保證染色效果與傳統(tǒng)效果類似的基礎(chǔ)之上，有效地克服了傳統(tǒng)高爾基染色耗時(shí)14天的長(zhǎng)時(shí)程操作、大大精簡(jiǎn)了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟，不需要不斷更新浸泡液，同時(shí)由于浸泡時(shí)間短和振動(dòng)切片機(jī)合理使用，有效克服了傳統(tǒng)切片操作難、易碎片的缺點(diǎn)。本發(fā)明方法為神經(jīng)元形態(tài)觀察提供了一種快速有效的新途徑，為神經(jīng)領(lǐng)域的臨床分析和科學(xué)研究提供了一種有效的檢測(cè)手段。

附圖說明

圖1到圖6為采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在不同浸染時(shí)間分別處理24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、3天、6天和9天后的錐體神經(jīng)元的示意圖。

圖7、圖8和圖9為本實(shí)施例中分別對(duì)不同腦組織采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在浸染時(shí)間為48小時(shí)的神經(jīng)元示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

下面結(jié)合附圖通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)的說明。

本發(fā)明基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，具體實(shí)施操作步驟包括：

1）配制銀染溶液：將質(zhì)量體積比濃度為5%重鉻酸鉀（國(guó)藥）、5%氯化汞（國(guó)藥）和5%鉻酸鉀（國(guó)藥）水溶液按1:1:1的體積比例配制混合好，避光放置。

2）準(zhǔn)備樣本：大鼠（SD）經(jīng)過二氧化碳麻醉后，利用蠕動(dòng)泵進(jìn)行心臟灌流，灌流液為生理鹽水，然后快速斷頭取腦，將半腦浸沒在已配好的銀染染色液中。

3）組織樣本浸染：按照1:5的體積比將腦組織侵入銀染溶液中，避光放置。在37±2℃環(huán)境溫度下浸泡36到48小時(shí)。