[發明專利]一種可增強固氮菌泌銨能力的基因

有效

• 申請號: 201310459866.4
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525830A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 平淑珍;趙仲麟;燕永亮;陸偉;林敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/21;C12N15/78;C12R1/38
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域：

本發明涉及一種可增強固氮菌泌銨能力的基因。

背景技術：

生物固氮的研究有助于增產糧食且不污染環境。泌銨菌向胞外環境分泌銨，為宿主植物提供一定量的氮素。

目前泌銨菌對于植物的促生作用的研究多局限于實驗室環境下，應用于大田環境還要從以下幾個因素對其進行改良：1）提高泌銨菌的根際定殖能力；2）結合態氮是抑制固定大氣氮的主要因素，高銨條件下提高泌銨菌的固氮能力和耐銨能力；3）在土壤微生物菌群中使泌銨菌成為優勢菌群；4）提高固氮能源的供給及優化其組成。

斯氏假單胞菌A1501（Pseudomonas?stutzeri?A1501）是一株聯合固氮菌，于1980年分離于我國南方水稻田。該菌株雖然具有明顯的固氮能力，但它們固定的氮素主要用來滿足自身的生長需要，而提供給植物的氮素有限。特別是在外界有銨的情況下，所固定的氮就更少，甚至停止固氮及泌銨，這就限制了聯合固氮菌的開發及在農業生產中的應用。

中國專利申請200910236131.9提供了一種重組泌銨菌，通過對斯氏假單胞菌A1501進行基因改造，缺失銨轉運載體蛋白amtB1、amtB2基因，同時轉入固氮酶正調節基因(nif?A)，該菌株命名為1561/pVA3，具有一定的泌銨能力。但對于固氮酶正調節基因(nif?A)進行突變，以提高其固氮和泌銨能力，獲得高效固氮的泌銨菌還未見報道。

本文中所稱的“斯氏假單胞菌”，亦可稱為“施氏假單胞菌”。

發明內容:

本發明的目的是用基因重組的手段對固氮酶正調節基因(nif?A)進行突變，并將其轉入斯氏假單胞菌A1561菌，開發新的高效泌銨的聯合固氮基因，以提供具有應用潛力的微生物菌肥。

本發明通過突變實驗得到具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的nif?AM基因，突變的基因可提高斯氏假單胞菌A1561泌銨量，并得到高效泌銨的聯合固氮菌，證實了上述發現。

nif?AM基因的獲得及菌株構建具體方法如下：

1.基因克隆

提取斯氏假單胞菌A1501的基因組，以所提取的基因組為模板，通過PCR方法獲得nif?A基因。以nif?A基因為模板，易錯突變方法突變nif?A基因。

2.載體構建

按常規方法克隆（New?York:Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press,1989）。克隆了固氮酶調節基因(nif?AM)，nif?AM核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

將含有完整的nif?AM的DNA片段連接到pVK100，構建了組成型表達質粒pVKAM。

3.三親接合

通過三親本接合將不能自我轉移的質粒導入受體菌中。

4.重組子的篩選及鑒定

挑出部分長出的菌落連續轉三次平板后，進行菌落PCR鑒定。之后，對泌銨情況進行鑒定。

經采用靛酚藍比色法進行測銨試驗，并與菌株A1561、1561/pVA3相比較（見實施例3），證實用本發明構建的聯合固氮菌株可高效泌銨，進而可為農作物提供氮肥，是一種潛在的微生物肥料。

附圖說明：

圖1為nif?AM基因同源片段的擴增結果；

圖2為大腸桿菌重組載體pVKAM的物理圖譜；

圖3為工程菌1561/pVA3、A1561、1561/pVKAM泌銨比較。橫坐標為培養天數，縱坐標為銨濃度。

序列表說明

1、SEQ?ID?NO:1nifAM的核苷酸；

2、SEQ?ID?NO:2是從SEQ?ID?NO:1推導出的nif?AM編碼的氨基酸序列。

具體實施方式

以下實驗中所用的實驗材料說明及來源如下：

菌株與載體：

大腸桿菌菌株E.coli?JM109購自Novagen公司；

斯氏假單胞菌A1561：由野生斯氏假單胞菌A1501缺失amtB1、amtB2基因后得到，來源于中國農業科學院生物技術所；

1561/pVA3菌株：為1561菌株中轉入nif?A基因（見中國專利申請200910236131.9），來源于中國農業科學院生物技術所；

pVK100載體：由Knauf等人于構建,見雜志Plasmid1982年，8:45-54，以下實驗用載體來源于中國農業科學院生物技術所。

酶與試劑盒：