[發(fā)明專利]檢測RRM1mRNA相對表達(dá)量的方法、試劑盒及引物和探針

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310459342.5
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103589786A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周曉犢;陳奕磊;王淑一;徐建成
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種定量檢測樣品中RRM1mRNA相對表達(dá)量的方法和試劑盒及其所使用的引物和探針，通過采用實時熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)悠分械腞RM1mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行定量檢測。?

背景技術(shù)

如今，肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤之一。根據(jù)病理學(xué)分類，確診的肺癌中約80%-85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small?cell?lung?cancer,NSCLC)。由于缺乏有效的早期診斷手段，初診時約75％的患者已錯過了最佳的手術(shù)時機，目前，預(yù)測NSCLC患者化療反應(yīng)的主要指標(biāo)還不甚明確，也是目前肺癌研究領(lǐng)域的熱點之一。有觀點認(rèn)為，應(yīng)當(dāng)引入個體化的分子標(biāo)志物指標(biāo)，以實現(xiàn)對NSCLC進(jìn)行個體化治療和預(yù)測。?

核苷酸還原酶(ribonucleotide?reductase,RR)是DNA合成通路中的限速酶，它能讓二磷酸核苷酸轉(zhuǎn)化為二磷酸脫氧核苷酸，而后者是DNA合成和修復(fù)所必不可少的原料。因此，RR是細(xì)胞存活的關(guān)鍵酶。RR包括2個亞單位：RRM1(ribonucleotide?reductase?M1)和RRM2(ribonucleotide?reductase?M2)。RRM2含有1個金屬結(jié)合位點，攜帶接觸抑制區(qū)，具有控制底物轉(zhuǎn)化的功能；RRM1含有核苷酸結(jié)合位點，控制底物的特異性和整個酶的活性，同時也是核苷類似物的化療藥物的結(jié)合位點。作為NSCLC的重要化療藥物，吉西他濱(gemcitabine)隸屬于嘧啶類抗代謝藥物，其作用靶點即為核苷酸還原酶(RR)。吉西他濱通過干擾核苷酸還原酶的功能而減少脫氧核苷酸的產(chǎn)生，最終影響DNA的合成。因此可推測RRM1的表達(dá)量可能與吉西他濱耐藥性有關(guān)。臨床結(jié)果顯示，在身體狀況、體質(zhì)等基本臨床因素相似的情況下，個體差異對吉西他濱的化療療效仍有著顯著影響。近來一些研究表明：當(dāng)吉西他濱作用于腫瘤細(xì)胞時，RRM1的表達(dá)量增高會使腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性增加。?

在實際應(yīng)用中，用于檢測RRM1表達(dá)的方法主要為免疫組化法，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，且試驗結(jié)果需要經(jīng)驗豐富的專家來判讀，判讀結(jié)果存在較大的主觀性，一定程度上限制了該法的應(yīng)用。正是因為免疫組化法存在這些問題，才促使本發(fā)明探索新的方法來檢測RRM1表達(dá)量。?

實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對擴增產(chǎn)物進(jìn)行實時在線檢測，反應(yīng)RRM1在組織中的初始含量，從而節(jié)約了大量的檢測時間，還避免了殘留污染的發(fā)生。?常見的實時熒光定量PCR法有SYBR?Green?I染料法，雙探針雜交法以及Taqman探針法等。其中SYBR?Green?I由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman探針法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。?

此外，利用結(jié)合Taqman探針法的實時熒光PCR技術(shù)定量檢測待測樣品中的RRM1基因表達(dá)量，僅僅通過設(shè)置看家基因actin作為內(nèi)參，來計算出待測樣品目的基因RRM1表達(dá)量與待測樣品看家基因actin表達(dá)量的比值仍然不足以判斷該表達(dá)量是否正常。?

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中檢測RRM1的不足，因此本發(fā)明采用實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合Taqman探針法應(yīng)用于RRM1基因相對表達(dá)量（即RRM1mRNA相對表達(dá)量）的定量檢測。本發(fā)明設(shè)計了檢測看家基因/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術(shù)檢測RRM1基因。通過調(diào)整兩個基因的引物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，開發(fā)出用于定量檢測樣品中RRM1mRNA的引物和探針，一種用于檢測樣品中RRM1mRNA相對表達(dá)量的核酸檢測試劑盒，一種定量檢測中RRM1mRNA相對表達(dá)量的方法。?

本發(fā)明提供定量檢測樣品中RRM1mRNA相對表達(dá)量的引物和探針，所述引物和探針包括檢測用上游引物RRM1-F、下游引物RRM1-R和探針RRM1-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探針Actin-Probe；其中所述引物序列為?

RRM1-F：GATTTCTCTTACAATTACTTC?

RRM1-R：GCCACTTTTCCATTGATCT?

RRM1-Probe：FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA?

Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT?

Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT?