[發明專利]中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法

有效

• 申請號: 201310457342.1
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103760344A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 馬鳴瀟;張大利;韓喜斌;袁小波;樊瓊;鄭洪玲;鄭林;李慧
• 申請（專利權）人: 遼寧醫學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 錦州遼西專利事務所 21225
• 代理人: 李輝

技術領域

本發明涉及一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法。?

背景技術

中華蜜蜂，又稱中華蜂、中蜂、土蜂，其抗寒抗敵害能力強，在寒冷的冬季也可以給植物授粉，因此，中蜂對保持我國植物生態系統特別是冬季開花的植物具有不可替代的作用，研究表明，如果中蜂滅絕，我國有30%的植物將要隨之滅絕。?

目前，為了加強中蜂產業的發展，在全國建立了中蜂保護區。然而，中蜂囊狀幼蟲病具有蔓延快的特點，一旦中蜂囊狀幼蟲病發生，就會迅速蔓延，給中蜂種群造成了毀滅性的打擊，使中蜂損失嚴重。?

CN102504023A公開了一種卵黃抗體的制備方法，該卵黃抗體能用于制備防治中蜂囊狀幼蟲病的藥物，但對抗中蜂囊狀幼蟲病病毒抗體的效價評估，還沒有相應的檢測方法，抗中蜂囊狀幼蟲病病毒抗體的效價評估不準確，導致卵黃抗體使用過量而浪費或卵黃抗體用量不足致使治療效果不能達到預期，直接制約了中蜂囊狀幼蟲病病毒抗體（卵黃抗體）的應用和研究。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法，可評價制備的中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的效價，以確定給藥量，達到預期治療效果，避免藥物浪費。?

本發明的技術解決方案是：?

一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法，其具體步驟如下：

1.1、用碳酸鹽緩沖液作為包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標板的酶標孔內，酶標孔每孔加入量為50μL～100μL，抗原含量為55ng/孔～65ng/孔，溫育，密封培養過夜，上層為液體，包被抗原吸附在酶標板上；

1.2.?棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復洗滌3次～5次，吸干水分；

1.3、向酶標孔內加入封閉液，每孔加入量為50μL～100μL，密封溫育或密封培養過夜，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復洗滌3次～5次，吸干水分；

1.4、將待檢卵黃抗體按2的倍數進行倍比稀釋，并依次加入酶標孔，同時設陰性對照卵黃抗體、陽性對照卵黃抗體，每孔加入量為50μL～100μL，在36.5℃～37.5℃下反應2h～3h，上層為液體，包被抗原與抗體復合物吸附在酶標板上；

1.?5、棄掉步驟1.4的上層液體，用PBST緩沖液洗滌被抗原與抗體復合物，重復洗滌3次～5次，吸干水分；

1.6、向酶標孔內加入稀釋的辣根過氧化酶標記的兔抗雞IgG，每孔加入量為50μL，在36.5℃～37.5℃下反應lh～1.5h后；棄掉上層液體，用PBST緩沖液進行洗滌，重復洗滌3次～5次，吸干水分；

1.7、向酶標孔內加入底物顯色液，每孔加入量為50μL～100μL，在室溫下避光顯色10min～15min，加入終止液，每孔加入量為5μL～10μL，終止反應；

1.8、用酶標儀在490nm～599nm下測定OD值，OD值≥1.7854為陽性，OD值＜1.7854為陰性，步驟1.4中倍比稀釋測定OD值是陽性的最大稀釋倍數為抗體效價。

本發明的有益效果：?

該檢測方法具有使用簡便，敏感性高，檢測成本低，生物安全度高等特點，可以評價制備的中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的效價，確保臨床上用量的準確性，達到預期治療效果，避免藥物浪費或用量不足。

具體實施方式

實施例1?

1.1、配制包被液（碳酸鹽緩沖液）：碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g,加蒸餾水稀釋定容至1000?mL，調PH至9.6；

用包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標板的酶標孔內，酶標孔每孔加入量為50μL，抗原含量為55ng/孔，在37℃下溫育1h后，在4℃下密封培養過夜，上層為液體，包被抗原吸附在酶標板上；

1.2.?配制PBST緩沖液：氯化鈉8g，氯化鈉:0.2g，磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉(12個結晶水)2.9g，Tween-20?0.5?mL，加蒸餾水稀釋定容至1000?mL，調PH至7.4；

棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復洗滌3次，吸干水分；

1.3、配制封閉液：5克脂奶粉用PBST溶解，定溶至100ml;

向酶標孔內加入封閉液，每孔加入量為50μL，在37℃下密封溫育1h，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復洗滌3次，吸干水分；