[發明專利]一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310456762.8
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN103509879A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 于可響;黃兵;李玉峰;馬秀麗;史玉穎;姜亦飛;林樹乾;宋敏訓;李峰
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院家禽研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

1.一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征是，它包括下述引物：

正向外引物DHV-F3：5'-ATCTGGYTGTGCTGTTGGRAT-3'；

反向外引物DHV-B3：5'-CATARCAYTGRTTGATGTCATAKCC-3'；

正向內引物DHV-FIP：5'-ACTCARAGABCCATCRAAWCCAGTTTTGAGTGGGAY?AATYTGTTRGC-3'；

反向內引物DHV-BIP：5'-CHCAYTATGTAACTGATGAGATHTGGTTTTACAGTRGT?RCAKGGDGAT?CCTGA-3'；

其中R＝A或G；Y＝C或T；H＝A,T或C；D=G,A或T；W＝A或T；B＝G,T或C；K＝G或T。

2.如權利要求1所述的一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，按50次量計包括以下組分：

1）TRIZol：50ml；

2）反應液：2000μL，包括10×Bst?buffer250μL、10mmol/L的dNTP100μL、25mmol/L的MgCl2300μL、5mol/L的betaine200μL、10μmol/L的外引物DHV-F3、DHV-B3各50μL、40μmol/L的內引物DHV-FIP、DHV-BIP各100μL、40U/μL的RNA酶抑制劑100μL、5U/μL的反轉錄酶AMV100μL、8U/μL的Bst?DNA聚合酶100μL、DEPC處理水550μL；

3）陽性對照：重組質粒T-DH250μL，濃度為0.1ng/μL；

4）DEPC處理水：1ml。

3.如權利要求2所述的一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，它還包括SYBR?GreenⅠ為100μL。

4.如權利要求2或3所述的一種鴨甲肝病毒通用的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述重組質粒T-DH的詳細制備方法為：提取A型鴨甲肝病毒RNA，利用外引物DHV-F3/DHV-B3進行RT-PCR，擴增目的條帶，反應條件如下：

RT反應體系：10mmol/L?dNTP1.0μL、5×RT緩沖液4.0μL、20pmol/μL的引物DHV-B31.0μL、40U/μL?RNA酶抑制劑0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR擴增儀進行反應，5U/μL反轉錄酶AMV1μL于70℃5min后加入；反應程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min；

PCR反應體系：ddH2O39μL、20pmol/μL的引物DHV-F31.0μL、10×PCR緩沖液4.5μL、5U/μL?Taq?DNA聚合酶0.5μL、RT產物5.0μL；置于PCR擴增儀進行反應，反應程序：95℃2min預變性；94℃變性15sec、60℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30個循環；72℃延伸5min。

回收目的條帶，與載體pMD18-T連接，轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，PCR鑒定陽性后進行測序，序列正確的質粒標記為T-DH作為鴨甲肝病毒的陽性對照。