[發明專利]艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法

有效

• 申請號: 201310456535.5
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525848A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 官玲亮;龐玉新;胡雄飛;吳麗芬;于福來;張影波;王丹;韋睿斌;陳振夏
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所;龐玉新
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/10
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及基因及其克隆方法，同時也涉及到基因編碼蛋白質，屬于生物技術領域，具體涉及一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS、其編碼蛋白質以及基因克隆方法。?

背景技術

艾納香(Blumea?balsamifera?L.DC.)為菊科艾納香屬多年生木質草本植物，主要分布于我國海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺灣等省。以其全草或地上部分入藥，具有鎮痛、發汗、祛風除濕、去痰止咳、通經止血等功效，在黎族、苗族、壯族等少數民族地區有著悠久的用藥歷史，是一種重要的民間藥物。同時艾納香也是獲取天然冰片（艾片）的重要植物來源之一。并且，在精制艾片過程中所產生的艾油具有擴張血管、降低血壓、抑制交感神經的作用，因而被廣泛應用于醫藥行業。另外，艾油因其獨特的芳香氣味，還被廣泛應用于香料以及化妝品行業。雖然以艾納香為原材料的產品眾多，然而關于其化學成分的研究較少。?

對于艾納香而言，其化學成分比較復雜，但具有藥理作用的主要集中在黃酮類和揮發油成分上。鄧芹英等（1996），曹家慶等（2008），陳銘等（2009）分別對艾納香中黃酮類成分進行了分析，主要含有艾納香素、木犀草素、槲皮素、兒茶素以及阿亞黃素等。關于艾納香揮發油成分的研究：周欣等（2001）、馬芝玉等（2009）采用GC/MS方法檢測到艾納香中揮發油成分主要為：L-龍腦、樟腦、β-石竹烯、芳樟醇、大葉香烯D、香木蘭烯、順-α-沒藥烯、β-蓽澄茄油烯、γ-依蘭?油烯、ent-貝殼杉烯等萜類化合物。除此之外，艾納香中還含有多其他種化合物，如小麥黃素、芹菜素、原兒茶酸（甲酯）、咖啡酸（甲酯）、香草酸等化合物。其中，ent-貝殼杉烯類二萜化合物具有廣泛的生理活性，主要表現為抗腫瘤活性。由于ent-貝殼杉烯類化合物主要來自于天然產物，化合物供應量非常有限。?

內根-貝殼杉烯合酶（KS）是貝殼杉烯類化合物合成過程中的關鍵酶之一，也是合成赤霉素等信號分子的關鍵酶，對植物的生長發育起著至關重要的作用。目前在研究植物生長發育及抗性中涉及較多研究，而從植物次生代謝及產物藥理藥效活性方面研究較少。KS過去被稱為內根-貝殼杉烯合酶B，位于前質體，具有引導序列，與古巴焦磷酸合酶（Copalyl?pyrophosphate?synthase,CPS）共同催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）形成內根-貝殼杉烯（ent-kaurene）。KS最早是從南瓜未成熟的種子中得到的，其突變嚴重影響植株的發育。擬南芥中的GA2蛋白編碼KS基因，在擬南芥的研究中發現，ga2矮化突變體是由KS基因的功能缺失造成的，對突變體ga2-1的序列進行分析，發現其cDNA中單堿基發生突變導致終止密碼子提前出現，從而使得KS基因失活。目前，KS基因在擬南芥、蓖麻、甜葉菊、梨、蘋果等植物上成功克隆，但目前還沒有關于艾納香內根-貝殼杉烯合酶（KS）基因的相關報道。因此，對艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因的克隆以及對他們的生物學功能研究，將有助于明確艾納香中二萜類次生代謝的分子機理，為調控其艾納香中有效成分等奠定基礎。?

發明內容

鑒于上述問題，本發明的主要目的在于提供一種首次從艾納香種獲得的內根-貝殼杉烯合酶基因。?

本發明的另一個目的是提供艾納香內根-貝殼杉烯合酶編碼的氨基酸序列及編碼蛋白質性質生物信息學預測。?

同時，本發明還提供該艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因的克隆方法。?

為了達到上述目的，本發明提供：?

本發明所提供的艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因，從艾納香（Blumea?balsamifera?DC）中克隆，命名為Bb-KS基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1。?

上述艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因編碼的蛋白質，命名為Bb-KS蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2。?

一種艾納香內根-貝殼杉烯合酶基因Bb-KS的克隆方法，包括如下步驟：?

（1）選用艾納香葉片作為試驗材料，采用TRNzol法提取總RNA；?

（2）采用TaKaRa公司生產的PrimeScriptTM?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit進行反轉錄獲得cDNA;?

（3）根據NCBI上其他植物KS基因保守區域，設計兼并引物PF1：TGGTCR(A/G)TTTGATCR(A/G)TATK(T/G)CAATC和?