[發(fā)明專利]一種喜樹愈傷組織培養(yǎng)和增殖的光調(diào)控方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310455667.6
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103493735A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設計）人: 黃華宏;林二培;樓雄珍;童再康;李許可
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物培育技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種喜樹愈傷組織培養(yǎng)和增殖的光調(diào)控方法。

背景技術(shù)

喜樹(Campototheca?acuminate?Decaisne)為珙桐科落葉喬木，我國特有樹種。1966年，美國的Monroe?E.WALL博士從喜樹的次生代謝產(chǎn)物中分離得到喜樹堿(Compothecine，簡稱CPT)。1985年，Hisang等發(fā)現(xiàn)CPT能阻斷拓撲異構(gòu)酶I的合成而具有抗癌效應。目前，已有多種以CPT為前體合成的喜樹堿衍生物用于臨床治療卵巢癌、結(jié)腸癌等，另外，CPT對HIV病毒也具有較強的抑制作用。隨著CPT抗腫瘤、抗病毒等功能的不斷挖掘、驗證，全球?qū)PT的需求量迅猛增加。自20世紀90年代來，美國、日本、加拿大和英國等國家積極投入大量人力物力進行喜樹引種栽培和CPT研發(fā)，喜樹成為紅豆杉之后第2個重要的木本抗癌藥用植物。但喜樹中CPT含量低，單純依靠從植株中提取CPT已不能滿足市場的需求，利用植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)高價值次生代謝產(chǎn)物在多種藥用植物中取得了成功，同樣，已有相關(guān)研究證實，通過喜樹愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)CPT是一種行之有效的途徑。

光作為一個重要的環(huán)境因子，對植物的生長發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用。顧青等研究了光照對喜樹愈傷組織生理生化特性及喜樹堿合成的影響，結(jié)果顯示，與暗培養(yǎng)相比，光下培養(yǎng)可以促進喜樹愈傷組織的生理代謝，且對喜樹堿的合成和積累有一定的促進作用。目前，日光燈是組織培養(yǎng)的主要光源，但其能耗高，壽命短，含汞，易造成環(huán)境污染，且光質(zhì)單一，不能滿足植物在組織培養(yǎng)不同生長階段對光質(zhì)的需求差異。發(fā)光二級管(LED)是一種能發(fā)光的半導體電子原件，通過化學修飾方法，調(diào)整材料的能帶結(jié)構(gòu)和禁帶寬度，可實現(xiàn)紅黃綠藍橙多色發(fā)光，滿足植物在組織培養(yǎng)不同階段對光質(zhì)的需求差異，同時，LED能耗較同效的白熾燈減少80％，無有害金屬汞，使用壽命可達10萬小時，《國家基本公共服務體系“十二五”規(guī)劃》指出要大力支持發(fā)展LED產(chǎn)業(yè)，在規(guī)劃期間LED燈將大量替代傳統(tǒng)日光燈在各行各業(yè)廣泛推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提出一種能有效提高喜樹莖段愈傷組織誘導率和增殖率的優(yōu)化培養(yǎng)基及LED組培光源調(diào)控方法。

一種喜樹愈傷組織培養(yǎng)和增殖的光調(diào)控方法，包括以下步驟：

1)將選取的喜樹春發(fā)新梢剪切成小段，用自來水沖洗干凈，用洗衣液溶液浸泡15min，流水下反復沖洗；

2)用流水沖洗干凈后，在75％乙醇溶液中浸1min，立即放人0.1％升汞溶液中消毒5min，無菌水沖洗5次后放在無菌濾紙上晾干備接種用；

3)將葉片剪成5mm×5mm，帶腋芽莖段切成2mm的小段，在無菌的條件下分別接入配制好的誘導培養(yǎng)基MS+0.1mg／L?KT+4mg／L2，4-D上，每配制1L培養(yǎng)基加入5.5g瓊脂和30g蔗糖，調(diào)pH至5.9，將誘導培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶40mL，在121℃下滅菌15min，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強度1000～1500lx，暗培養(yǎng)一周，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，每天光照時間12h；

4)誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，30d繼代1次，繼代培養(yǎng)基為B5+0.5mg／L?KT+1.0mg／L?NAA+0.5mg／L2，4-D，5.5g／L瓊脂和30g／L蔗糖，pH為5.9；

5)30d繼代1次，連續(xù)繼代5次后，挑選疏松易碎的愈傷組織進行LED光下培養(yǎng)。

進一步優(yōu)選，步驟5)中采用綠光微繼代的光質(zhì)。

本發(fā)明提供的提高喜樹莖段愈傷組織增殖率的LED光源調(diào)控方法，其為在愈傷組織增殖階段，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至光譜波長為500～580nm、光量在105μmol·m^-2·s^-1左右的LED綠光下培養(yǎng)。

本發(fā)明的優(yōu)化培養(yǎng)基和LED組培光調(diào)控方法能有效地提高喜樹愈傷組織誘導率和增殖率，為獲得大量的CPT提取原料喜樹愈傷提供了技術(shù)保證，此外，本發(fā)明還能降低能耗，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

以喜樹當年生無病蟲害的幼嫩莖段為外植體。莖段采摘清洗后，在75％乙醇溶液中消毒1min，立即放人0.1％升汞溶液中繼續(xù)消毒5min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干水分，備用。