[發(fā)明專(zhuān)利]一種發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株及其篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310455589.X
• 申請(qǐng)日: 2013-09-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103614313A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高兆建;李勇;張桂英;張建萍;張家路;司瑞寒;田圣英
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12N9/38;C12R1/125
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 樓然

1.一種發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69的分類(lèi)命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2012年1月9日，保藏編號(hào)為：CGMCC?No.5699。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株F69（CGMCC?No.5699）具有以下特性：

(1)?生長(zhǎng)條件：枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）F69所產(chǎn)β-半乳糖苷酶的生長(zhǎng)溫度55～75℃，最適生長(zhǎng)溫度65℃；

(2)?酶活性：在50℃～80℃下保溫90min，殘余酶活在80％以上，在80℃和90℃下保溫60min，殘余酶活分別為85％和65％；?

(3)?弱酸性：在pH5.5～7.5之間酶活性在80%以上，在pH?4.5～7.5之間保持81%以上的酶活性，最適作用pH為6.5。

3.基于權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株的篩選方法，其特征在于依次包括如下具體步驟：

步驟一，富集培養(yǎng)：取土樣1g研細(xì)，加入裝有80ml?無(wú)菌水的250ml?三角瓶中，加入無(wú)菌玻璃珠，在150r/min搖床中振蕩20min，然后在80℃震蕩水浴搖床中震蕩30?min，取1?-2?ml于50?mL富集培養(yǎng)基中，40℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)36h-48h，震蕩頻率為150-180r/min；

步驟二，初篩：將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋至稀釋倍數(shù)為10^-8，分別取10^-6、10^-7、10^-8三個(gè)梯度的稀釋液0.2ml涂布在初篩分離培養(yǎng)基平板上，平板晾至表面沒(méi)有流動(dòng)液體時(shí)，在40～42℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～36h，然后將培養(yǎng)溫度降到32～35℃，繼續(xù)培養(yǎng)24～72h；挑取藍(lán)色菌落至另一個(gè)初篩分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：溫度40～42℃，培養(yǎng)時(shí)間30～36h；經(jīng)培養(yǎng)后菌落呈現(xiàn)深淺不一的藍(lán)色，進(jìn)一步選取藍(lán)色較深的菌株劃線純化；

步驟三，菌株純化：將初篩出來(lái)的菌株，于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線，置于40～42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次在顯微鏡下觀察到形態(tài)單一的菌體則認(rèn)為菌株已純化；

步驟四，復(fù)篩：初篩后將經(jīng)過(guò)純化的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，容量為250ml的三角瓶裝液量為30ml，在溫度為40～45℃，震蕩頻率為160～180r/min下，恒溫震蕩搖床培養(yǎng)18-22h，然后按照4～6%的接種量接種到復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床震蕩發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為：在250ml三角瓶中裝培養(yǎng)基30～50ml，搖床震蕩頻率為160-200r/min，發(fā)酵溫度40～45℃，發(fā)酵時(shí)間為36～48h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液8000r/min離心10min，上清液為粗酶液，測(cè)定各粗酶液的β-半乳糖苷酶酶活性，其中菌株F69產(chǎn)β-半乳糖苷酶活性最強(qiáng)，活力高達(dá)182U/ml；

步驟五，菌種保藏：將復(fù)篩得到的菌種在斜面培養(yǎng)基上劃線，40～45℃培養(yǎng)3天，然后置于4℃冰箱保存；

步驟六，β-半乳糖苷酶酶活性測(cè)定：取500?μL待測(cè)酶液加入到已經(jīng)預(yù)熱到65℃的1.5?mL含有2?mmol/L?ONPG的0.1?mol/L磷酸緩沖液（pH?6.5）中，65℃水浴保溫10?min后，加入1mL?1mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，A₄₀₅測(cè)定光吸收值，計(jì)算水解產(chǎn)物鄰硝基酚的含量和酶的活性，同時(shí)以0.1?mol/L?pH?6.5磷酸酸緩沖液代替酶液作為對(duì)照，乳糖酶活性的定義：1個(gè)單位的乳糖酶的活性為在pH?6.5、65℃下每分鐘分解ONPG生成l?μmol鄰硝基酚(ONP)所需的酶量。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株的篩選方法，其特征在于步驟一所述的富集培養(yǎng)基為：乳糖2g、酵母粉0.5g、蛋白胨1g、NaCl?0.5g和蒸餾水100ml，條件：pH?6.5、滅菌溫度121℃、滅菌時(shí)間20?min。