[發(fā)明專利]一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310454553.X
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN104513850A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王阿慧
• 申請（專利權(quán)）人: 上海滿益科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/44;C12Q1/48
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

發(fā)明領(lǐng)域??

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法。

發(fā)明背景

目前的準(zhǔn)則規(guī)定，存在于重組治療性蛋白質(zhì)的核酸量小于10?pg的每日劑量的重組蛋白的DNA。因此，用于檢測核酸的量極低的方法是必要的。這種方法也將得到廣泛的使用，法醫(yī)樣品中的DNA的定量。?已經(jīng)描述的核酸檢測的低水平的幾種方法。第一種方法是基于經(jīng)典的雜交技術(shù)。此方法利用放射性標(biāo)記的核酸探針結(jié)合到感興趣的DNA。然而，這種方法有幾個(gè)缺點(diǎn)，包括再現(xiàn)性差，產(chǎn)生大量廢試劑，引起的非特異性結(jié)合的高背景水平。此外，這種技術(shù)用于確定低量的未知序列的DNA的存在通常是不適當(dāng)?shù)?檢測核酸的第二種方法利用能夠插入到核酸的熒光染料。然而，如清潔劑，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的許多干擾物質(zhì)影響通過該方法產(chǎn)生的信號(hào)的再現(xiàn)性，?利用生物素化的檢測的DNA的水平低的第三種方法的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB），鏈霉抗生物素蛋白，抗稠合到脲酶DNA抗體，以及作為試劑的生物素化的硝化纖維素。此法是市售Kung等分子器件和描述，皮克總DNA定量使用SNA-結(jié)合蛋白在硅基于傳感器的系統(tǒng)，肛交。生物化學(xué)。187：220-27（1990）。該試劑盒的操作，允許將要形成一個(gè)復(fù)雜的的鏈霉抗生物素蛋白，生物素，SSB，抗DNA抗體一起孵育。然后將復(fù)合體上的生物素化的過濾器捕獲，洗滌，讀取捕獲的脲酶的量。此方法是高度敏感的，但是有幾個(gè)缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)包括昂貴的試劑和廣泛的控制的需要。?第四種方法包括解聚或降解核酸和檢測由熒光素酶的ATP。多核苷酸聚合酶的核酸在細(xì)胞中的合成負(fù)責(zé)。這些酶也能夠德意志和Kornberg，脫氧核糖核酸酶催化合成，生物化學(xué)雜志中所描述的催化其它反應(yīng)。化學(xué)?244（11）:3019-28（1969）。很多，但不是全部，聚合酶能夠解聚磷酸鹽或焦磷酸鹽存在下，無論是在核酸?的美國專利。第4735897號(hào)描述了一種方法，檢測的多聚腺苷酸化，信使RNA（聚（A）-mRNA的）。解聚的聚（A）-mRNA的磷酸鹽的存在已被證實(shí)會(huì)導(dǎo)致在形成ADP，它可以被轉(zhuǎn)換為ATP由丙酮酸激酶或肌酸磷酸激酶。RNA也可通過核糖核酸酶消化AMP，腺苷酸激酶轉(zhuǎn)化為ADP，然后轉(zhuǎn)換為ATP的丙酮酸激酶?的ATP這樣生產(chǎn)的熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測。在ATP和O2的存在下，熒光素酶催化熒光素的氧化作用，產(chǎn)生光，然后可以使用光度計(jì)定量。其他反應(yīng)的副產(chǎn)物是AMP的磷酸鹽，焦磷酸鹽和氧合蟲熒光素，?ATP的產(chǎn)生在所有的生物體中的酶的存在下，也允許使用熒光素酶系統(tǒng)的，用于檢測污染細(xì)胞的存在或量的樣品中，如描述在美國專利。第5648232號(hào)。例如，可能會(huì)增加ADP懷疑含有污染細(xì)胞的樣品。轉(zhuǎn)換的ADP轉(zhuǎn)化為ATP酶的細(xì)胞的熒光素酶測定法檢測，如上所述。這種方法的缺點(diǎn)是相對(duì)不穩(wěn)定的ADP襯底，?這是本領(lǐng)域需要的是可靠的，成本效益的方法，核酸，細(xì)胞，細(xì)胞物質(zhì)在多種類型的樣品的檢測非常低的水平。本發(fā)明公開了新穎的方法，用于檢測的DNA，RNA和細(xì)胞數(shù)量低。這些方法利用焦磷酸或核酸酶降解的新穎的組合，轉(zhuǎn)換為ATP的dNTPs，直接向ATP，AMP的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增的ATP敏感性增加，寡核苷酸探針的解聚，和優(yōu)化的反應(yīng)條件。?

發(fā)明內(nèi)容

核酸和多孔材料與ATP的檢測系統(tǒng)檢測的極低量的方法和組合物進(jìn)行了描述。?背景?生產(chǎn)大量的重組蛋白質(zhì)的方法是眾所周知的。重組蛋白行業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種質(zhì)量控制檢測的需要。一個(gè)例子是需要重組蛋白抽提物中存在的核酸的定量分析。