[發明專利]一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑及應用

有效

• 申請號: 201310454128.0
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103497935A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 虞方伯;單勝道;管莉菠;葉正錢;駱林平
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;B09C1/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于酶基因工程及酶工程領域，涉及一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑及應用。

背景技術

隨著我國工業化進程的加快，有機工業合成廢水的排放量越來越大。有機工業合成廢水不僅含大量有機物，且存在大量對生物體有毒害作用的物質，已對環境造成了嚴重的污染，威脅到人類生命健康。參照急性毒性分級標準，鄰硝基苯甲醛(o-nitrobenzaldehyde，ONBA)為中等毒性化合物。ONBA是重要的精細有機化工中間體，廣泛用于醫藥、染料和有機合成，如用于合成抗心絞痛藥物硝基吡啶(心痛定)、鄰硝基苯乙烯類及鄰硝基肉桂酸類系列產品等。將其硝基還原成氨基后，所得到的鄰氨基苯甲醛還可用于喹啉類化合物的合成，其工業需求量十分大。但由于其生產過程伴隨著大量污染物質的產生，發達國家已將其生產線轉移到發展中國家(污染轉移)，這一點在我國東南部地區尤為明顯。具不完全統計，東南地區年產鄰硝基苯甲醛在70萬噸以上，且絕大多數生產廢水未經處理就直接排放，對周邊環境造成了極大的損害。在一定程度上，可以說這一點源污染已成為面源污染。

硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化學法和微生物降解法三種。物理和化學方法雖然能夠有效去除此類物質，但成本高，需要特制的儀器和裝備，且酸、堿易腐蝕，具有一定的危險性。實際上，硝基芳香化合物在環境中的降解和轉化主要是由微生物完成的(微生物對其的代謝多通過一系列酶促反應完成)。因此，如何充分利用功能微生物資源，去除特異性污染物，成為了相關環境修復的研究熱點。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑。

本發明的另一目的是提供該酶制劑的應用。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑，所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM的MgCl₂，反應體系pH值為6.5-8.0。酶制劑為緩沖溶液時，該緩沖溶液一般為pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液。酶制劑中鄰硝基苯甲醛降解酶的純酶含量一般為0.03-0.1mg／mL。進一步的，所述的MgCl₂終濃度為0.2mM。

一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑的制備方法，其特征在于：取純化酶液樣本20mL和氯化鎂，用pH值7.5的80mM磷酸鈉緩沖液定容至1L制成酶制劑，酶制劑中氯化鎂的終濃度為0.1-0.3mM。

所述純化酶液樣本的制備方法如下：挑取含有重組質粒的菌株，該重組質粒上含有nbaA基因編碼片段，用LB培養基于37℃培養，待A_600nm值為0.6時，加入IPTG至終濃度1mM，隨后于20℃過夜表達；離心收集細胞，重懸于80mM?pH7.5的磷酸鈉緩沖液，在冰水浴中超聲破碎細胞——功率為400W超聲波破碎5s，暫停15s，共進行60個循環；隨后，于4℃，10000g離心30min去除細胞碎片，上清液即為粗酶提取液；使用一站式組氨酸標簽蛋白純化試劑盒對所述粗酶提取液進行純化，獲得純化酶液樣本。

一種所述的酶制劑在降解土壤中鄰硝基苯甲醛中的應用。應用所述酶制劑降解土壤中鄰硝基苯甲醛時，體系溫度為18-40℃，pH為6.0-8.5。

本發明通過克隆Pseudomonas?sp.ONBA-17中負責ONBA降解的脫氫酶基因并表達，獲得了ONBA降解酶，為ONBA的降解提供有效的生物降解手段，對于ONBA污染環境的修復具有重要意義。該菌是假單胞菌屬(Pseudomonas?sp.)的菌株ONBA-17，于2013年9月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC?No.8095。保藏單位的地址為北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，該菌的分類命名為假單胞菌Pseudomonas?sp.。

本發明采用的NbaA酶對ONBA的酶活力為2442U／mg，分別是NahF酶活力(552U／mg)和NahV酶活力(245U／mg)的442.4％和996.7％，顯著強于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分別為62％和89％。由上可知，基因序列的不同引發了酶的空間構象的差異，并最終致使酶作用能力產生差異。

本發明酶制劑的有益效果主要體現在以下幾個方面：