[發明專利]一種pH穩定比酶活高的重組堿性果膠酶及其構建方法

在審

• 申請號: 201310453358.5
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN103881996A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 張桂敏;徐婷;宋江寧;馬延和
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及一種pH穩定性、比酶活得到提高的重組堿性果膠酶和其編碼基因，及其構建方法，屬于生物遺傳工程技術領域。?

背景技術

果膠酶是分解果膠質的多種酶的總稱。果膠酶按其作用最適pH?分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。酸性果膠酶的酶作用最適pH在偏酸性范圍，廣泛應用于果汁和酒類的提取以及飼料工業（鄔敏辰，2006）。堿性果膠酶的酶作用最適pH在8.0-10.0，目前在植物藥提取、茶和咖啡發酵、油提取，紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、含果膠工業廢水處理及生物技術等行業的應用越來越受到重視，所以成為人們研究的熱點（Jayani?RS，et?al.?Process?Biochemistry?40?：2931-2944，2005）。?

果膠酶可來源于植物和微生物，但植物天然來源的果膠酶產量低且提取困難，難以大規模制備；微生物具有生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊和分布廣等特點（華寶玉等，?2012），易于進行基因改造，為果膠酶的廣泛工業化應用打下堅實基礎。?

本發明前期研究的堿性果膠酶基因pel168來源于Bacillus?subtilis?168，含有1263bp的開放閱讀框，編碼420個氨基酸，通過SignalP分析，顯示該氨基酸序列含有21個氨基酸的信號肽。將該基因pel168在大腸桿菌中進行了表達，表達所得果膠酶PEL168經純化后進行酶學性質的研究表明，該酶的最適溫度為50°C，最適PH為9.4。但是，這種堿性果膠酶在pH為3～6時，相對活性降低40%，并且比酶活也較低（Chengjie?Zhang?et?al,?BMC?Biotechnology，2013）。?

在工業化應用中，酶的pH適應范圍窄將需要更多的技術來維持反應體系中pH的穩定，同時需要大量的酸或堿來中和，就造成成本高、用水量大、能耗高、耗時長，廢液中COD值高等問題，同時果膠酶的高效性，多用性的研究也迫在眉睫。因此，獲得更加高效、多用、穩定的果膠酶，就成為更好的研究開發與應用果膠酶的關鍵。?

發明內容

本發明的目的是提出一種pH穩定性、比酶活較高的重組堿性果膠酶及編碼基因，及其構建方法。.?

本發明是這樣實現的。在GenBank?收錄號AL009126中含有的果膠酶基因pel168，對應果膠酶PEL168的氨基酸序列收錄號為CAB12585.1，設計點突變引物（FP和RP）進行定點誘變，將公布的基因457位的鳥嘌呤G變成胸腺嘧啶T，獲得pel168V132F，使得其編碼氨基酸序列成熟肽的第132位的纈氨酸V（GTC）突變成苯丙氨酸F(TTC)，獲得重組堿性果膠酶PEL168V132F。

V132F,氨基酸序列具體如下?

1????ADLGHQTLGS??NDGWGAYSTG???TTGGSKASSS???NVYTVSNRNQ??LVSALGKETN

51???TTPKIIYIKG????TIDMNVDDNL???KPLGLNDYKD???PEYDLDKYLK???AYDPSTWGKK

101??EPSGTQEEAR??ARSQKNQKAR???VMVDIPANTT???IFGSGTNAKV???VGGNFQIKSD

151??NVIIRNIEFQ???DAYDYFPQWD???PTDGSSGNWN??SQYDNITING???GTHIWIDHCT

201??FNDGSRPDST??SPKYYGRKYQ????HHDGQTDASN??GANYITMSYN??YYHDHDKSSI

251??FGSSDSKTSD???DGKLKITLHH????NRYKNIVQRA???PRVRFGQVHV??YNNYYEGSTS

301??SSSYPFSYAW???GIGKSSKIYA????QNNVIDVPGL???SAAKTISVFS????GGTALYDSGT

351??LLNGTQINAS???AANGLSSSVG???WTPSLHGSID???ASANVKSNVI???NQAGAGKLN*

G變T,DNA序列如下

1??atgaaaaaag??tgatgttagc??tacggctttg??tttttaggat??tgactccagc??tggcgcgaac