[發(fā)明專利]一種NK細(xì)胞的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310452975.3
• 申請日: 2013-09-28
• 公開（公告）號: CN103484429A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐矯健;孫威
• 申請（專利權(quán)）人: 青島麥迪賽斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種自然殺傷細(xì)胞（Natural?Killer,NK）的培養(yǎng)，即利用轉(zhuǎn)基因飼養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞因子聯(lián)合刺激外周血單核細(xì)胞（Peripheral?Blood?Mononuclear?Cell,PBMC），獲得大量高純度的NK細(xì)胞。

背景技術(shù)

NK細(xì)胞是一群較大的顆粒化的淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞表面表達(dá)CD56且缺少CD3的表達(dá)，所以，通常用表面標(biāo)志CD3^‐CD56⁺來界定NK細(xì)胞。NK細(xì)胞大約可以占到外周血淋巴細(xì)胞的5‐15%，同時分布在人體肝臟、比臟、骨髓和淋巴結(jié)等部位。

NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)重要的組成部分，可以通過多種方式對腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞造成殺傷：1、與靶細(xì)胞接觸后，釋放穿孔素和顆粒酶；2、通過自身表達(dá)的配體，刺激并活化靶細(xì)胞表面的死亡受體；3、通過抗體依賴的細(xì)胞毒作用對靶細(xì)胞造成殺傷。

由于NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞可以做出快速的免疫反應(yīng)，所以在機(jī)體的免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用。有研究表明，NK細(xì)胞不足的患者更容易受到嚴(yán)重的系統(tǒng)性病毒感染。外周血中NK細(xì)胞活性高的男性患腫瘤的幾率要低10%，而在女性中這一數(shù)值是4%。并且，NK細(xì)胞在腫瘤組織中的侵潤提示較好的預(yù)后。

由于NK細(xì)胞不需要特異性的抗原刺激，即可對腫瘤細(xì)胞造成殺傷的特性，使其在臨床上獲得了廣泛的應(yīng)用，并取得了一定的療效。但是，無法在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的高純度NK細(xì)胞，成為了進(jìn)一步提高臨床治療效果的瓶頸。

最初，NK細(xì)胞的活化刺激主要依靠高濃度的IL‐2，經(jīng)兩周的培養(yǎng)，僅能獲得10倍左右的增殖。隨后，研究人員嘗試了使用多種因子組合比如IL‐12、IL‐15、IL‐21、CD2抗體等刺激NK細(xì)胞，但是獲得的NK細(xì)胞的數(shù)量和純度都有限。飼養(yǎng)細(xì)胞的使用，使NK細(xì)胞的培養(yǎng)效率獲得很大的提高。比如，用轉(zhuǎn)染CD137L和mIL‐15的K562細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，可以刺激NK細(xì)胞獲得超過200倍的增殖。尋找更加理想的刺激NK細(xì)胞增殖的方法，已成為科研人員的重要目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種NK細(xì)胞的高效制備方法，即通過聯(lián)合細(xì)胞因子和飼養(yǎng)細(xì)胞的刺激作用，提高NK細(xì)胞的增殖速度和純度。

申請人在長期的研究中發(fā)現(xiàn)，將NCR3LG1基因轉(zhuǎn)染到飼養(yǎng)細(xì)胞中后，可以刺激活化NK細(xì)胞，使其快速增殖，而且它與膜表達(dá)的mIL‐15對NK細(xì)胞的刺激有協(xié)同作用。申請人將NCR3LG1和IL‐15同時轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中，作為飼養(yǎng)細(xì)胞刺激活化NK細(xì)胞，同時添加IL‐2和IL‐21細(xì)胞因子，極大的提高了培養(yǎng)NK細(xì)胞的效率，從而促成了本發(fā)明。

上述NK細(xì)胞的高效制備方法，包括如下步驟：

1)使用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將NCR3LG1基因核苷酸片段和包含有mIL‐15基因的核苷酸片段同時轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞，作為制備NK細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞；

其中NCR3LG1基因核苷酸片段的序列為：SEQ?ID?NO:1，包含有mIL‐15基因的核苷酸片段的序列為SEQ?ID?NO:2；

2）將從外周血分離得到的PBMC用培養(yǎng)液重懸后，接種培養(yǎng)瓶中，同時接種滅活的K562飼養(yǎng)細(xì)胞和IL‐2和IL‐21因子進(jìn)行培養(yǎng)；

3）培養(yǎng)4天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)；

4）持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至第7天，再次添加滅活的K562細(xì)胞進(jìn)行二次刺激；

5）持續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至第21天，收獲細(xì)胞，完成NK細(xì)胞的制備。

本發(fā)明步驟2）所述的培養(yǎng)液，其配方組成如下:氯化鈣40mg/ml、氯化鉀300mg/ml、硫酸鎂120mg/ml、氯化鈉5000mg/ml、磷酸二氫鉀300mg/ml、碳酸氫鈣1200mg/ml、氨基酸1365mg/ml、維生素21.4mg/ml、微量元素0.93126mg/ml、白蛋白450mg/ml、胰島素8mg/ml、亞油酸0.4mg/ml、油酸5mg/ml、谷胱甘肽2.5mg/ml、雙甘氨肽mg/ml、次黃嘌呤0.8mg/ml、硫辛酸0.1mg/ml、丙酮酸150mg/ml、葡萄糖1500mg/ml、胸腺嘧啶0.12mg/ml。

其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份谷氨酸、12份甘氨酸、4份組氨酸、80份異亮氨酸、4份亮氨酸、4份賴氨酸、20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份絲氨酸、8份蘇氨酸、3份色氨酸、10酪氨酸、17份纈氨酸。