[發明專利]一種從基因組DNA中獲得側翼序列的方法

有效

• 申請號: 201310452575.2
• 申請日: 2013-09-25
• 公開（公告）號: CN104450675B
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 張立峰;韓素英;齊力旺;李水根;張俊紅
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林業研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

1.一種從基因組DNA中獲得側翼序列的方法，包括如下步驟：

（1）選擇基因組DNA上位于待擴增的側翼序列旁側的一個已知序列區，根據所述已知序列區的核苷酸序列設計三條方向一致用于擴增所述側翼序列的特異性引物，將三條所述特異性引物按照距離所述側翼序列由遠及近的順序，依次記為GSP1、GSP2和GSP3；

（2）以所述基因組DNA為模板，以隨機兼并引物SAP和所述GSP1進行第一輪PCR擴增，得到PCR產物1；

所述隨機兼并引物SAP為如下15種引物中的任一種：核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15；

（3）以所述PCR產物1為模板，以疊套引物SEP和所述GSP2進行第二輪PCR擴增，得到PCR產物2；

所述疊套引物SEP由引物A和引物B組成，所述引物A的核苷酸序列為序列表中序列16，所述引物B的核苷酸序列為序列表中序列17；

（4）以所述PCR產物2為模板，以引物SNP和所述GSP3進行第三輪PCR擴增，得到PCR產物3；從所述PCR產物3中獲得所述側翼序列；

所述引物SNP的核苷酸序列為序列表中序列18；

進行所述第一輪PCR擴增的反應條件為：94℃ 120 s，1個循環；98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃2 min，2個循環；98℃ 10 s，25℃ 2 min，0.2℃/s，68℃ 2 min，1個循環；98℃10 s，60℃30 s，68℃2 min，98℃ 10 s，60℃ 30s，68℃ 2 min，98℃ 10 s，44℃ 30 s，68℃ 2 min， 3-5個循環；68℃ 5 min，1個循環；

進行所述第二輪PCR擴增的反應條件為：94℃ 120s；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min，30個循環；68℃ 5min；

進行所述第三輪PCR擴增的反應條件為：94℃ 120 s；94℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 2 min，30個循環；68℃ 5min；

進行三輪PCR擴增時的反應體系如下：

（a）進行所述第一輪PCR擴增的反應體系為：2×PCR Buffer for KOD FX 10.0μL；2mM dNTPs4.0μL；濃度為10μmol的所述GSP1 0.6μL；濃度為10μmol的所述隨機兼并引物SAP 3.0μL；基因組DNA 200-500ng；1.0U/μL KOD FX 0.4μL；ddH₂O補足至20μL；

（b）進行所述第二輪PCR擴增的反應體系為：2×PCR Buffer for KOD FX 25.0μL；2mM dNTPs 10.0μL；濃度為10μmol的所述GSP2 1.5μL；混合濃度為2.2-2.5μmol的所述疊套引物SEP 7.5μL，其中，引物A的濃度為0.2-0.5μmol，引物B的濃度為2μmol；所述PCR產物1 1.0μL；1.0U/μL KOD FX 1.0μL；ddH₂O補足至50μL；

（c）進行所述第三輪PCR擴增的反應體系為：2×PCR Buffer for KOD FX 25.0μL；2mM dNTPs 10.0μL；濃度為10μmol的所述GSP3 1.5μL；濃度為10μmol的所述引物SNP 1.5μL；所述PCR產物2，1.0μL；1.0U/μL KOD FX 1.0μL；ddH₂O補足至50μL。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述疊套引物SEP中，所述引物A和所述引物B的摩爾比為（1-2.5）：10。