[發明專利]嘌呤核苷磷酸化酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201310451323.8
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103468656A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 李子樵;沈露
• 申請（專利權）人: 上海藍怡科技有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/10;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

1.一種突變的假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，與野生型的氨基酸序列相比，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突變為Tyr。

2.如權利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一種或多種特性：

(a)比酶活≥30U/mg，較佳地為≥45U/mg；

(b)儲存在堿性環境中；

(c)失活溫度≥60℃；

(d)在0－55℃，保存時間≥3h。

3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權利要求1所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶。

4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權利要求3所述的多核苷酸。

5.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求4所述的載體或基因組中整合有權利要求3所述的多核苷酸。

6.如權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌(E.coli)細胞。

7.一種權利要求1所述突變的嘌呤核苷磷酸化酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)在適合表達的條件下，培養權利要求5所述的宿主細胞，從而表達出權利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶；

(b)分離所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶。

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟(a)之前，所述方法還包括以下步驟：

(1)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，并且任選地，將所述多核苷酸序列中編碼氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leu134和Leu145中的一個或多個密碼子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替換為大腸桿菌相對應的偏愛密碼子，從而制得編碼權利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(3)將上一步驟制得的所述多核苷酸序列導入宿主細胞，從而制得權利要求5所述的宿主細胞。

9.一種改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

(1)提供一假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(2)將所述多核苷酸序列中對應于野生型假交替單胞菌屬的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密碼子突變為編碼Tyr的密碼子，從而制得編碼突變的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；

(3)表達上一步驟制得的所述多核苷酸序列，從而制得突變的嘌呤核苷磷酸化酶。

10.一種權利要求1所述的突變的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷進行磷酸解反應；或用作對肌苷進行磷酸解反應的催化劑。