[發(fā)明專利]二次酶解制備幾丁聚糖的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310450751.9
• 申請日: 2013-09-29
• 公開（公告）號: CN104046668A
• 公開（公告）日: 2014-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郁正剛;黃永亮;田志同;苗勝昆;李瑩;楊國元
• 申請（專利權(quán)）人: 天津天獅生物發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12N9/80;C12R1/66
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技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及幾丁聚糖制備方法，屬于制造領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甲殼素是一種天然含氮多糖物質(zhì)，廣泛存在與無脊椎動物的外殼或角質(zhì)層中，尤其是蝦蟹類的外殼中。甲殼素很容易獲得，可再生，是僅次于纖維素的天然均聚物，但是因分子內(nèi)部有很強的氫鍵作用，溶解性低，應(yīng)用范圍受到限制。

甲殼素脫乙酰后生成殼聚糖。目前殼聚糖的制備多采用化學(xué)法和酶解法脫乙酰?；瘜W(xué)法脫乙酰反應(yīng)中，影響脫乙酰的因素很多，但是主要影響因素包括：堿液濃度、反應(yīng)溫度和時間。一般來說，提高反應(yīng)溫度和延長反應(yīng)時間均可提高脫乙酰度，但是會導(dǎo)致甲殼素主鏈降解增加，從而影響產(chǎn)品的粘度和分子量。通入氮氣可以在一定程度上減緩主鏈的降解。由于化學(xué)法使用的堿液濃度高，反應(yīng)時間長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，環(huán)境污染嚴重。

酶解法不會降解主鏈，并且無污染，具有重要的研究開發(fā)價值。影響酶解的因素很多，主要包括PH值和溫度。文獻記載最適宜PH值4-8，最適宜溫度30-70℃（《甲殼酶特性與應(yīng)用研究》?萬云洋等?《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》?2003?vol?15?No.6）。迄今為止發(fā)現(xiàn)的真菌甲殼質(zhì)脫乙酰酶（CDA）都是糖蛋白，且有良好的熱穩(wěn)定性。但是不同來源CDA的存在位置、最適宜PH值（PH4.5-12）、碳水化合物含量、相對分子質(zhì)量及離子影響等有較大的差異。

迄今報道的CDA基本都來源于真菌。真菌來源的CDA主要作用是自身細胞壁的合成，最適底物一般為甲殼寡糖，對甲殼質(zhì)的活性較低，不適合用酶法脫乙酰生產(chǎn)殼聚糖。真菌來源的CDA來源廣泛，獲取容易，成本相對較低。因此如何能夠?qū)⒄婢鷣碓吹腃DA用于制備殼聚糖成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種新的幾丁聚糖制備方法，所述的方法能夠較現(xiàn)有技術(shù)更節(jié)能環(huán)保。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用真菌來源的CDA制備幾丁聚糖的方法，所述的方法能夠解決現(xiàn)有技術(shù)CDA不適于生產(chǎn)幾丁聚糖的技術(shù)難題。

本發(fā)明的另一目的是提供一種安全的幾丁聚糖制備方法，所述的方法制得的幾丁聚糖無強酸或強堿殘留，產(chǎn)品更安全。

本發(fā)明的另一目的是提供一種具有市場競爭力的幾丁聚糖，所述的產(chǎn)品不因工藝的改進而增加生產(chǎn)成本。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案實現(xiàn)：

干燥粉碎、檸檬酸酸脫鈣；氫氧化鈉脫蛋白；酶解脫蛋白；甲殼質(zhì)脫乙酰酶脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。

本發(fā)明采用制備方法對脫鈣前的蟹殼或蝦殼進行預(yù)處理，然后再進行脫鈣和脫蛋白。

為增強脫鈣和脫蛋白效果，本發(fā)明優(yōu)選的將蟹殼或蝦殼粉碎至25～40μm顆粒，顆粒過小則增加生產(chǎn)成本，顆粒過大效果較差。發(fā)明人經(jīng)過多次試驗及經(jīng)驗，最終確定25～40μm顆粒范圍達到脫鈣和成本的最佳性價比。

本發(fā)明粉碎后的原料加入4-8倍重量體積比的水制成料液，再加入10～15%檸檬酸酸，充分反應(yīng)后，過濾，水洗至中性，留取殘渣。殘渣中加入8～15%氫氧化鈉溶液，80-100℃，1-3h，水洗至中性，過濾，留取殘渣。

本發(fā)明的酶解采用菠蘿蛋白酶較其他蛋白酶具有更好的酶解效果。當然，選用其他蛋白酶進行酶解也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明工藝中最佳酶解方案是將第一次脫蛋白后的殘渣中加入4-8倍重量體積比的水，再加入菠蘿蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5～6.5，40～60℃攪拌1～2h；分離液體，殘渣再次重復(fù)提取。

酶解殼料所用的蛋白酶占殼料重量比為0.05～0.2%為佳。

酶解脫鈣和脫蛋白后，過濾，棄濾液，留取殘渣，殘渣即為甲殼質(zhì)。將甲殼質(zhì)加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比（g/l）1～3:1～6，0.2MPa，30～32℃,48～72h，120℃，20min，干燥即得幾丁聚糖。

所述的可以從公開市場上購得，也可以通過構(gòu)巢曲霉菌發(fā)酵后制得。

所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法如下：

（1）制備發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉8g，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂1g，二氯化鈷（0.01mol/l）10ml，水1000ml；

（2）發(fā)酵條件：發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接入構(gòu)巢曲霉菌，30～35℃，PH6.0～7.0，72～96h。

經(jīng)過二次脫鈣和脫蛋白后，去除了原料中的鈣離子、蛋白質(zhì)其它有機物質(zhì)。

本發(fā)明所述的幾丁聚糖脫乙酰度高達95%以上。