[發明專利]一種快速獲取大量優質神經干細胞的培養方法

有效

• 申請號: 201310450694.4
• 申請日: 2013-09-25
• 公開（公告）號: CN104087553B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 赫榮喬;劉纓;付晶鵬;莫煒川
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

1.一種提高神經干細胞培養效率的方法，所述方法包括：

(1)亞磁細胞培養環境控制：在鋁合金制作的支架上，用0.5mm厚，磁通透性為20000的磁屏蔽金屬坡莫合金包裹制作成亞磁屏蔽箱，纏繞層數12層，箱體最終尺寸以長*寬*高計為470mm*641mm*6511mm，在箱體頂部開直徑0.5mm的小孔，分別安裝進氣扇和出氣扇，箱體邊側開門；將亞磁屏蔽箱被放置在細胞培養箱中，細胞培養箱的環境：溫度37℃，濕度95％，CO₂濃度5％；通過運行磁屏蔽箱頂部的風扇，箱體內的環境與外部進行交換，保持內外環境一致；亞磁環境的總磁場強度小于500nT；

(2)神經干細胞原代培養：將小鼠處死，取出腦，浸泡在冰冷的HEM中；在體視顯微鏡下，取出SVZ區組織放在冰冷的HEM溶液中；用剪刀將組織破碎成大塊，加6mL 0.05％胰酶后轉移到15mL離心管中，37℃消化10min；在混懸液中加入等體積的胰蛋白酶抑制劑終止消化，室溫靜止3分鐘后在100g離心5分鐘；去上清液，在沉淀物中加入2mL NSA+/+，反復吹打把組織打散成單細胞懸液；細胞懸液用40μm濾網過濾，用額外2mL NSA+/+沖洗離心管和過濾網，獲得的所有濾液轉移到新的離心管中；再次在100g離心5分鐘，去上清液，沉淀物用1-2mLNSA+/+重懸獲得細胞懸液；用血球計數板數計算細胞密度，按照80萬細胞每T25細胞培養瓶接種，添加5mL NSA+/+；1000個細胞/孔，200μL NSA+/+，放在步驟(1)中的亞磁環境中培養7天以上；

所述HEM溶液為：MEM一袋，HEPES 3.813g，加ddH2O至0.875L，添加2％雙抗；

所述NSA+/+溶液為：NSA-/-50mL，3.78mg/mL的Heparin 50μL，1μg/mL的EGF 100μL，0.1μg/mL的bFGF 50μL；

所述NSA-/-溶液為：NSA 44mL，10％BSA 1mL，Proliferation Supplement 5mL，雙抗1％；

所述NSA溶液為：DMEM/F12一袋，Glucose 3.75g，碳酸氫鈉1.125g，HEPES 1.192g，加ddH2O至0.9L；

所述0.05％胰酶為：胰蛋白酶0.05g，EDTA 0.004g，加PBS 100mL；

所述胰蛋白酶抑制劑為：胰蛋白酶抑制劑11.2mg，1mg/mL的DNase I 0.8mL，HEM79.2mL；

(3)神經干細胞傳代：將步驟(2)得到的原代神經干細胞細胞在亞磁環境中培養7天后，收集所有的神經球，在100g離心5分鐘；添加0.05％胰酶或accutase在常溫消化3分鐘，加入等量胰蛋白酶抑制劑，輕輕混勻，在100g離心5分鐘；吸去上清后，加入1-2mL NSA+/+，反復吹打制成成單細胞備懸液；按照10萬細胞接種到60mm細胞培養皿，添加5mLNSA+/+；1000個細胞每孔，200μL NSA+/+，放在步驟(1)的亞磁環境中培養7天以上。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述神經干細胞來自于新生P2小鼠、P15或成年小鼠。