[發明專利]具嚴格等級結構的三維礦化膠原支架的制備方法、及其產品和應用

有效

• 申請號: 201310449456.1
• 申請日: 2013-09-24
• 公開（公告）號: CN103536965A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 劉燕;周彥恒;劉帥;付玉
• 申請（專利權）人: 北京大學口腔醫學院
• 主分類號: A61L27/24
• 分類號: A61L27/24;A61L27/12;A61L27/56
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種礦化膠原支架的制備方法，特別涉及一種具嚴格等級結構的三維礦化膠原支架的制備方法、及其產品和在制備骨組織修復材料中的應用。屬于骨組織修復與治療領域。

背景技術

骨組織是自然界中一種具嚴格等級結構，多功能礦化組織。在生命過程中，它不斷地改建來適應外界機械應力，維持離子平衡并修復缺損。骨缺損的再生與修復一直是醫學研究的重要課題。自體骨移植一直被認為骨缺損治療的金標準。但由于來源有限及取材部位需二次手續而受到質疑。近年來，組織工程通過模擬天然骨組織的化學成分，物理性能及顯微結構特點來解決這一難題。礦化膠原作為骨組織最基本的等級結構，被認為是最理想的骨再生修復材料。而傳統方式合成的礦化膠原僅僅只實現了和骨組織一致的化學成分，并未復制其等級結構。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中存在的缺點和不足提供一種具嚴格等級結構的三維礦化膠原支架的制備方法、及由該方法獲得的產品和在制備骨組織修復材料中的應用。

為了達到上述目的，本發明采用的技術手段為：

本發明的一種具嚴格等級結構的三維礦化膠原支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）膠原磷酸化：將盛有3－4mg/ml鼠尾I型原膠原溶液的透析袋，浸泡于質量百分含量為1.25－2.5％的三聚磷酸鈉溶液中5－10min，使膠原磷酸化；

（2）無定型磷酸鈣（ACP）的制備：將0.5g－1g?I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30－40ml含0.5－1mg/ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37℃反應1－2d，得到含有大小為45-50nm的納米無定型磷酸鈣的溶液；

（3）膠原的纖維化及再礦化：將步驟（1）得到的磷酸化的膠原置于步驟（2）得到的含ACP的溶液中，膠原質量與溶液體積比例為0.5-1mg：1ml，5－7d后，磷酸化的膠原將誘導納米無定型磷酸鈣在膠原纖維內的有序排列與成核，形成具嚴格等級結構的礦化膠原；

（4）三維礦化膠原支架的合成：將步驟（3）得到的礦化膠原于0.1M磷酸緩沖液中透析30min，之后置于4℃，3000－5000g離心5－10min，去掉上清液，向沉淀中加入適量的0.1M磷酸緩沖液，充分混勻后制備成懸濁液，倒入24孔板，于-25～-40℃冷凍24－48h，并凍干形成三維的疏松的多孔礦化膠原支架；再使用含有1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亞胺及N-羥基丁二酰亞胺的混合液交聯4－24h，采用甘氨酸溶液與雙蒸水交替沖洗，凍干，即得到孔徑為80－300μm的，具嚴格等級結構的三維礦化膠原支架。

在本發明中，優選的，步驟（2）中所述的人工模擬體液，其溶質組成如下：136.8mM?NaCl，4.2mM?NaHCO₃，3.0mM?KCl，1.0mM?K₂HPO₄·3H₂O，1.5mMMgCl₂·6H₂O，2.5mM?CaCl₂，0.5mM?Na₂SO₄以及3.08mM?Na₃N，溶劑為水，用HCl和NaOH溶液調節pH=7.0。

在本發明中，優選的，步驟（4）中向沉淀中加入的0.1M磷酸緩沖液的體積為沉淀體積的1/20－1/10。

在本發明中，優選的，步驟（4）中，所述的混合液按照以下方法制備得到：使用摩爾濃度為0.3mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亞胺溶液及摩爾濃度為0.06mol/L的N-羥基丁二酰亞胺溶液按照體積比＝1：1配制。

在本發明中，優選的，步驟（4）中所述的甘氨酸溶液的質量百分濃度為1％。

本發明中，將0.5g－1g?I型白色硅酸鹽水門汀浸泡于30－40ml含0.5－1mg/ml聚丙烯酸的人工模擬體液中，于37℃反應1－2d，I型白色硅酸鹽水門汀在人工模擬體液中將逐漸釋放Ca²⁺和OH-，使溶液的pH升高至9.5－10，Ca²⁺與PO₄^3-結合形成ACP，帶負電的聚丙烯酸將吸附在ACP表面，從而控制ACP的大小約45－50nm（納米ACP）；