[發明專利]PTEN基因干擾shRNA3和重組腺病毒載體及構建

有效

• 申請號: 201310449441.5
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN103497952A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 付世新;羅春海;賀顯晶;沈冰蕾;郭景茹
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/861;C12N15/66;A61K48/00;A61P1/16
• 代理公司: 大慶市建華專利事務所 23119
• 代理人: 孫薇

技術領域

本發明屬于動物分子生物學和基因工程領域，涉及一種PTEN基因干擾shRNA3和重組腺病毒載體及構建。

背景技術

圍產期奶牛脂肪肝是因圍產期奶牛能量負平衡導致的代謝性疾病，但因沒有有效的防治措施給養牛業帶來了巨大的損失，尋找一種有效的治療方法迫在眉睫。鑒于圍產期奶牛（特別是荷斯坦品種奶牛）肝臟氧化脂肪酸的能力弱，合成和分泌脂蛋白能力不足是脂肪肝發生的主要環節，建立調控肝臟脂肪酸氧化和VLDL分泌與合成的基因療法，或許能為圍產期奶牛脂肪肝的防治提供新思路。

磷酸酶張力蛋白同系物（Phosphoatase?and?tensin?homolog，PTEN）是迄今發現的第一個具有雙重特性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，通過對細胞內多條信號轉導通路的負性調控，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，誘導腫瘤細胞凋亡，對維持細胞的正常生理活動發揮重要作用。PTEN的抑癌功能一直是腫瘤發生發展中的研究熱點。然而，近來越來越多的研究發現：PTEN通過其脂質磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依賴于磷酸酶的生物活性，在脂肪肝臟的發生和發展方面發揮著重要的作用。

最近幾年，對PTEN基因及其蛋白的研究已經延伸至其他領域，而不再僅僅局限于腫瘤。肝臟是機體內重要的新陳代謝器官，在正常機體內，PTEN基因及其蛋白有相對較高的表達。PTEN基因及其蛋白的異常表達除了會在肝細胞癌中出現，也在其他肝臟疾病發生的重要調節。

分子生物學技術，在研究生物學功能和疾病治療等方面發揮著重要的作用，尤其是RNAi技術近年來得到了很大的應用，使用該技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。

（1）RNAi技術的選擇

基因功能研究進入了后基因組時代，需要一種完美有效的研究方法進行基因功能分析。現如今，基因沉默技術包括三種類型：同源重組、隨機插入突變和RNA干擾。RNAi技術，特異性降解相應序列的mRNA，導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能型缺失的現象，屬于轉錄后水平的基因沉默(post-transcript?gene?silencing，PTGS)。從1990年第一次被報Napoli和van?der?Krol等報道后，就廣泛的應用于植物、低等動物和哺乳動物的基因功能分析。主要是通過小于38nt雙鏈RNA（dsRNA）抑制哺乳動物細胞基因的表達，而介于38nt到1662nt大小的RNAsq不能有效抑制基因表達，主要是因為大于38nt的dsRNA可引起哺乳動物細胞的死亡。通常使用21-23nt大小的小干擾RNA（siRNA）進行操作，能獲得比較好的干擾效果。尤其是因其高效性、特異性和穩定性的優點，可有效的阻斷特定基因的表達而廣泛被應用于哺乳動物基因功能的研究。它即適用于單個基因或基因通路功能研究，也適用于疾病（包括遺傳性疾病）和病毒作用等關鍵基因功能的研究，還可以通過RNAi發現誘導疾病發生的關鍵新基因。所以RNAi已成為基礎醫學和生物醫學研究的主要技術，將廣泛應用于臨床實踐中，包括某些癌癥、家族遺傳疾病、自身免疫疾病和病毒感染性疾病的治療。與其他治療方法相比，RNAi技術最大的優勢是可以全面的作用于靶目標，包括一些藥物不能作用的靶組織或者靶蛋白，可通過改變幾個核苷酸序列來影響與疾病發生相關的等位基因的表達。

另外RNAi技術已逐漸應用到脂肪代謝領域，RNAi可以通過控制循環血脂水平，來調節像肌肉和肝臟等組織的脂肪酸代謝，從而調控全身代謝和對胰島素的敏感性。VPuri等開發的RNAi篩選，可以確定培養的脂肪細胞中哪些基因是調節胰島素關鍵通路的信號。如篩選出可以識別轉錄共抑制因子RIP140，RIP140減少可增加了基因簇的表達，可影響對葡萄糖的攝取、糖酵解、三羧酸循環、脂肪酸氧化、線粒體生物合成和氧化磷酸化。而沒有RIP140的小鼠高脂肪飼料耐受，體重增加同時葡萄糖耐受增強。

（2）RNAi有效片段的篩選

RNAi主要是通過dsRNA參與指導，以外源和內源mRNA為降解目標，將與靶基因的mRNA同源互補的dsRNA導入細胞，特異性地降解該mRNA，從而產生相應的功能表型缺失的技術。但外源性siRNA如何能導入哺乳動物細胞，是今年來研究的熱點和重點。尋找一種安全高效引入體內的方法成為試驗成功的基礎保障。