[發明專利]豬NLRC5基因全長克隆及表達量的熒光定量檢測方法

無效

• 申請號: 201310446798.8
• 申請日: 2013-09-26
• 公開（公告）號: CN103820429A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 蘭道亮;陳亞冰;李鍵;熊顯榮;林寶山;王樹茂
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 張澎

1.一種豬NLRC5基因全長序列克隆方法，其特征在于是運用人類、小鼠等物種NLRC5基因已知片段設計分段擴增的引物，用豬的小腸組織提取總RNA，進行RT-PCR擴增，用擴增到的NLRC5基因片段作為已知序列，采用3’RACE技術，獲得3’端未知序列，拼接獲得其全長cDNA序列；利用Real-time?PCR技術檢測NLRC5基因在不同組織中的表達量。

2.如權利1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，其特征在于，所述獲得的全長cDNA全長序列如序列表中的SEQ?ID:1所示，它的編碼區從第123個核苷酸到5660個核苷酸。

3.如權利要求1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，所述獲得的全長cDNA全長序列的氨基酸序列對應于序列表中的SEQ?ID:2。

4.如權利要求1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，分段擴增的引物為：

1S：5’-GGGCCTGTCCTATGGAAAGAA-3’

1A：5’-CTGCTGTCGTAACGCTGCTG-3’

2S：5’-GGACCCCATTAGTCGCCAC-3’

2A：5’-CAGCCACGCAGTGACATAGC-3’

3S：5’-TGGACAGAGACACACTTGCCC-3’

3A：5’-GCCACCAGTTGACAGCCTTC-3’

4S：5’-TGTCTCCGTGTCAACTCTCCTC-3’

4A：5’-CCTCTGCTGTCACCGCTCA-3’

5S：5’-ACGGTTTGTCCCTGGATGCT-3’

5A：5’-GCCACGGCTTCTGGGTTCT-3’

6S：5’-AGGCAACGTCACTGAAATAAGC-3’

6A：5’-CACAGGCGAATGACTTGGAT-3’

7S：5’-TCAACTTGGCCGAGAACAGC-3’

7A：5’-AGGGGACCTGTGGCTGATG-3’

8S：5’-GACAACCAGACTGCCAAGCC-3’

8A：5’-CTTGGGCCTTCTTGGAAACA-3’。

5.如權利要求1所述之豬NLRC5基因全長序列克隆方法，基因3’端添加含有一段特殊接頭引物的Oligo(dT)18作為鎖定引物反轉錄合成第一鏈cDNA；用基因特異引物GSP作為上游引物，用含有部分接頭序列的引物作為下游引物，以cDNA第一條鏈為模板，采用TaKaRa?LA聚合酶進行巢式PCR，把目的基因3’末端的DNA片段擴增出來；RACE引物序列如下：

Race引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3’

GSP1：5’-GGAACTGGCTCACCCCTCCCGTA-3’

Out?primer：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’

GSP2：5’-CGCTGGACCCGGCCACTACCTCA-3’

Inner?primer：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

6.一種NLRC5表達量的熒光定量檢測方法，利用熒光定量PCR技術檢測NLRC5基因在不同組織中的表達量，采用SYBR?Green?I實時熒光定量方法對NLRC5基因在豬不同組織表達量進行檢測分析，熒光定量引物如下：

QNLRC5-S：5’-AACTTGGCCGAGAACAGC-3’

QNLRC5-A：5’-TTCCACAGGCGAATGACTT-3’

Qactin-S：5’-GTCATCACCATCGGCAACG-3’

Qactin-A：5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCATT-3’。