[發明專利]一株生防枯草芽胞桿菌桿菌霉素L分離純化方法

無效

• 申請號: 201310444933.5
• 申請日: 2013-09-27
• 公開（公告）號: CN104513294A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 羅楚平;陳志誼;王曉宇;劉永鋒;劉郵洲;張榮勝;周華飛
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K7/56
• 分類號: C07K7/56;C12P21/02;G01N27/447
• 代理公司: 暫無信息
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1.一株枯草芽胞桿菌胞外脂肽抗生素桿菌霉素L，其特征在于：從枯草芽胞桿菌胞外產物中分離純化后獲得；通過電噴霧四級桿飛行時間串聯質譜測定，分子量為1021.5、1035.5和1049.5等相差一個亞甲基(-CH₂)的桿菌霉素L同系物。

2.一種如權利要求1所述的一株枯草芽胞桿菌胞外桿菌霉素L的分離純化方法，其特征在于：

a、從保藏號為CGMCC?No.0808的枯草芽胞桿菌B.subtilis916中構建脂肽抗生素泛革素合成缺失的突變株BFM；

b、從雙突變株BFM的發酵液中采用酸沉淀甲醇抽提分離表面活性素的粗提物；

c、將粗提物采用去離子水稀釋為含30％甲醇水溶液，pH值調至7.0，然后上樣于NH₂固相萃取柱，分別用含50％甲醇水溶液，100％甲醇，含0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脫，在紫外光210nm處檢測，其中在含1％甲酸甲醇洗脫溶液中檢測到桿菌霉素L；

d、將含1％甲酸甲醇洗脫溶液的pH值調至7.0，氮氣吹干濃縮、再用去離子水稀釋為30％甲醇水溶液，然后上樣于C18固相萃取柱；采用梯度洗脫30％，50％，70％，90％甲醇水溶液洗脫，在紫外波長210nm處檢測，其中在含70％甲醇水洗脫溶液中檢測到桿菌霉素L；

e、將70％甲醇水洗脫溶液氮氣吹干后再用去離子水稀釋為40％甲醇水溶液，再上樣于C18固相萃取柱；采用10倍柱體積的50％，55％，60％，65％，70％，75％甲醇水溶液梯度洗脫，其中在60％、65％洗脫液得到目標化合物表面活性素，合并60％、65％洗脫液氮氣吹干濃縮后真空干燥，得到桿菌霉素L的純品；

f、提取的桿菌霉素L采用Tricine-SDS-PAGE檢測，已經達到電泳純，即只有一條帶。提取的桿菌霉素L高效液相色譜的檢測條件為：采用C18(5μm；250by4.6mm；VYDAC218TP；VYDAC，Hesperia，CA)柱；流動相為乙腈：水：三氟乙酸(40：60：0.5vol／vol)；流速為1mL·min^-1；紫外檢測波長為210nm；已經達到色譜純。

3.根據權利要求2所述的一種枯草芽胞桿菌胞外桿菌霉素L的分離純化方法，其特征在于：從保藏號為CGMCC?No.0808的雙突變株BFM中分離脂肽粗提物是：將突變株BFM轉接到LB培養液中，在28℃、180r／min條件下振蕩培養72h，發酵液離心除去菌體，用濃鹽酸調至pH2.0沉淀過夜，8000g離心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物經0.22μmol·L^-1微孔濾膜后，即為粗制備的桿菌霉素L樣品。