[發(fā)明專利]一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310444865.2
• 申請日: 2013-09-25
• 公開（公告）號: CN104450872A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余堅;高維強;趙仰星;孫晉楓;張紅宇;顧峻;何英華;王韋
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/08;C40B50/06
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學的DNA甲基化分析領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測方法。

背景技術(shù)

DNA序列改變以外的調(diào)控機制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中更為普通和重要，這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調(diào)控機制被稱為表觀遺傳學機制，包括組蛋白乙酰化、DNA甲基化、MicoRNA、非編碼長RNA等。其中以DNA甲基化研究最為深入，無論在針對個別基因、還是在新興的全基因組學層面以及功能調(diào)控領(lǐng)域都被廣泛研究，并且在腫瘤臨床實踐的診斷和治療中的DNA甲基化的應(yīng)用前景也受到了很大的重視。在腫瘤細胞中，一些原本在正常細胞中處于低甲基化狀態(tài)的基因呈現(xiàn)出高甲基化的狀態(tài)并轉(zhuǎn)錄失活，受累基因包括抑癌基因、DNA修復(fù)基因、細胞周期控制基因和抗凋亡基因等，由此促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化的研究不僅可以從新的角度使人們進一步了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，腫瘤細胞DNA呈現(xiàn)出的異常甲基化譜式已經(jīng)成為一個新的腫瘤生物標志物的研究領(lǐng)域，而且由于DNA甲基化修飾的可逆性，使其也具有成為分子治療靶點的可能。

當今DNA甲基化研究的主要方法分為全基因?qū)用婧突驅(qū)用妗Ｔ谌蚪M層面包括以DNA雜交為基礎(chǔ)的芯片技術(shù)，有用特定蛋白富集基因組中甲基化DNA片段后再與芯片雜交的CHIP-chip技術(shù)和將基因組DNA進行亞硫酸修飾后與芯片雜交的methylation?array技術(shù)；以高通量為基礎(chǔ)的下一代測序技術(shù)，其中同樣包括用特定蛋白富集基因組中甲基化DNA片段后進行測序的方法如MethylCap-seq、MeDIP-seq和將基因組DNA進行亞硫酸修飾后進行高通量測序的方法如Genome-wide?Bisulfite-seq、Reduced?Representation?Bisulfite?Sequencing(RRBS)。需要說明的是只有Genome-wide?Bisulfite-seq、Reduced?Representation?Bisulfite?Sequencing(RRBS)這2種方法是單堿基分辨率的DNA甲基化檢測方法，其他組學研究方法都需后續(xù)的單基因單位點層面的甲基化狀況檢測驗證。在特定基因?qū)用娴臋z測方法包括以PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))為基礎(chǔ)對特定DNA序列的MSP(甲基化特異性PCR)、qMSP(熒光定量甲基化特異性PCR)、MSRE-qPCR(甲基化敏感內(nèi)切酶酶切定量PCR)；以測序為基礎(chǔ)的BSP(亞硫酸處理PCR產(chǎn)物測序)、焦磷酸測序。以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)方法簡便，但僅對引物或探針退火的幾個CpG(CG二核苷酸)位點進行檢測。焦磷酸測序一個反應(yīng)只能對60bp左右的特定序列中的CpG位點進行甲基化檢測，檢測1個樣本需200元，當需檢測大樣本受檢樣本和多區(qū)域甲基化水品時，價格極其昂貴，如需檢測100個樣本中5個區(qū)域的甲基化水平，大致費用為：100*5*200=10萬元。而BSP方法是最為常用的特定位點單堿基分辨率的甲基化檢測，可對500bp內(nèi)的PCR產(chǎn)物中的多個CpG檢測，但一個PCR反應(yīng)只能檢測一個樣品的一個特定位點，且需對PCR產(chǎn)物進行復(fù)雜的連接克隆轉(zhuǎn)化，并對克隆進行5個以上的一代測序(每個測序成本最少30元)，無法進行多樣本多位點的甲基化檢測，特別是微量DNA樣本的多特定位點甲基化檢測，當檢測大樣本，多區(qū)域甲基化水平時，同樣價格昂貴，同樣如需檢測100個樣本中5個區(qū)域的甲基化水平，大致費用為：100*5*5*30=75,000元。

綜上所述，當今的甲基化組學研究都需要在后續(xù)的試驗中，在多樣本(臨床樣本或細胞樣本)中對批量的來自于甲基化組學中特定位點進行驗證，但上述的基因?qū)用娴募夹g(shù)都無法勝任這種多樣本多位點的高通量單堿基分辨率甲基化檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種高通量檢測目的基因組的甲基化水平的檢測方法，所述方法包括：

(1)提取n個受試樣本的目的基因組DNA；其中n為≥10的正整數(shù)(較佳地，n為10-500的正整數(shù)；如15，20，50，100，140，150，200，300，400)；

(2)對來自n個受試樣本的目的基因組DNA分別用重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理，分別獲得n種處理產(chǎn)物；

(3)分別以(2)的n種處理產(chǎn)物為模板，分別用BSP引物組擴增含有CpG位點的序列，獲得一一對應(yīng)每一受試樣本的n種擴增產(chǎn)物；