[發(fā)明專利]一種制備植物促根劑的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310444657.2
• 申請日: 2013-09-26
• 公開（公告）號: CN103535352A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李興林;韓廣建;曹愛佳;張國運;曹雪飛;趙娜;韓楊;賈士儒
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: A01N43/16
• 分類號: A01N43/16;A01P21/00;C12P19/04
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技術(shù)領(lǐng)域

一種制備植物根系促生劑的方法。該方法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。采用這一技術(shù)，可以快速、大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的香菇多糖、并降低其生產(chǎn)成本。生產(chǎn)的根系促生劑能有效促進(jìn)植物根系的旺盛生長，而對植物的其他器官影響較小，并且不受該物質(zhì)高濃度的抑制，明顯優(yōu)于其他植物激素或生長調(diào)節(jié)劑。可以廣泛應(yīng)用于農(nóng)林、食品和環(huán)境等領(lǐng)域。

背景技術(shù)

香菇多糖對動植物具有多種有益作用，一般采用從子實體中提取，生長周期長、分離成本高。因而，香菇多糖的生產(chǎn)和應(yīng)用受到很大的限制。采用耐酸菌絲實施深層開放式培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)，以可以克服這些缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

采用香菇子實體等來制備高活性菌絲、對菌絲進(jìn)行誘變并依次通過酸性液體培養(yǎng)基(pH1.0-4.0)、珍珠巖固體培養(yǎng)基初步篩選耐酸菌絲突變體；經(jīng)過多次酸性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)和典型的拮抗測試復(fù)篩獲得耐酸突變體；耐酸突變體經(jīng)振蕩培養(yǎng)形成分散良好的細(xì)胞系；優(yōu)化培養(yǎng)工藝，在pH2.0-4.0的培養(yǎng)基中深層開放式培養(yǎng)；從發(fā)酵液收集濾液，經(jīng)熱水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脫蛋白→H202脫色→透析脫鹽→DEAE-纖維素(DEAE-52)柱層析→Sephadex?G-100柱層析→純多糖(中性多糖、酸性多糖)；純多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生劑。這種方法可快速、低成本、大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的香菇多糖。

具體實施方式

1采用香菇子實體等來制備高活性菌絲

1)供試培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加蒸餾水定容至1L，pH自然。選擇質(zhì)量好的馬鈴薯洗凈后，去皮，挖去芽眼，削掉青綠部分。切成小塊(約1.0cm×1.5cm至2.0cm×3.0cm)。稱取馬鈴薯200g，加水約1L，溫火煮沸并保持30min，馬鈴薯塊變軟時用4層紗布過濾，濾汁內(nèi)加入瓊脂和葡萄糖，在文火上使瓊脂融化，加水補(bǔ)足1L，分裝后加瓊脂經(jīng)120℃高壓濕熱滅菌20min。

(2)液體種子培養(yǎng)基(w／v)：馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，初始pH6.0。

(3)搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基(w／v)：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，KH₂P0₄0.2％，MgS0₄0.1％，初始pH2.5。

2)香菇菌絲培養(yǎng)

(1)菌種活化

將保存于試管斜面培養(yǎng)基上的香菇菌種用接種鏟切出0.5cm×0.5cm大小的菌塊接種于倒平板的PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)6d。

(2)液體種子培養(yǎng)

將已活化的斜面菌種切割成0.5cm×0.5cm大小菌塊，接種于液體種子培養(yǎng)基中，每個250mL三角瓶接5塊菌塊，10個大小均一的玻璃珠，培養(yǎng)基裝液量100mL，于25℃，150r／min培養(yǎng)6d，制備成發(fā)酵種子液。

(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將搖瓶菌種在25℃靜置24h后，用勻漿器將其勻漿。250mL三角瓶裝培養(yǎng)基100mL，液體菌種接種量為10％，于25℃，150r／min培養(yǎng)12d。

3)菌種分離及純化

香菇菌種分離就是把香菇菌絲體從混雜的微生物環(huán)境中單獨分離出來，并進(jìn)行純培養(yǎng)。可采用孢子分離法和組織分離法。

孢子分離得到的菌絲具菌齡短，生活力強(qiáng)等優(yōu)點，并具有雙親遺傳特性，是選育高新菌株和雜交育種的材料，但由于其染菌率過高，因而，目前香菇生產(chǎn)上最常使用的1種分離方法為組織分離法。即就是利用香菇子實體組織，分離培養(yǎng)出香菇的純菌種。具體做法為選擇個體典型，朵多，蓋厚無病蟲危害，最好是用未成熟的菌蕾作為分離材料。用75％酒精沖洗種菇表面進(jìn)行消毒，再用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干。用消過毒的刀片在菇柄中部縱切一刀，用手掰開菌蓋，在菌蓋與菌柄交界處取米粒大小的小塊組織，移接到PDA斜面培養(yǎng)基上，加上棉塞，在25℃條件下培養(yǎng)。

菌種的純化及擴(kuò)大培養(yǎng)：菌種分離培養(yǎng)3d～4d后，選取菌絲萌發(fā)早，長勢旺的菌落，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)菌種一般在8d～12d可長滿管。香菇菌種肉眼觀察PDA斜面上菌絲生長潔白，羽毛狀沿著培養(yǎng)基表面延伸，至此得到試管菌種(即母種)。

4)耐酸性香菇誘變菌絲篩選

(1)紫外輻照處理