[發明專利]遲鈍愛德華氏菌的冷凍真空干燥保護劑及其凍干方法

有效

• 申請號: 201310443283.2
• 申請日: 2013-09-26
• 公開（公告）號: CN103468573A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 張正;王印庚;于永翔;廖梅杰;榮小軍;史秀清;李彬;王嵐
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李素紅

技術領域

本發明屬于海洋細菌冷凍真空干燥保存技術領域，具體地涉及一種適用于遲鈍愛德華氏菌的真空冷凍干燥保護劑及其凍干方法。

背景技術

遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella?tarda)，又名遲緩愛德華氏菌，在世界范圍內廣泛分布于海、淡水環境中，是水生生物的重要致病菌，可引起魚類、兩棲類等多種水產經濟動物的疾病，對養殖生產構成嚴重的威脅（鄭大海等2004）。因此，有關遲鈍愛德華氏菌的研究逐漸成為水產養殖病原學研究領域的一個熱點，國內外學者對遲鈍愛德華氏菌的分類、致病機理、抗原特性和疫苗等方面都進行了較為深入的研究（Matt?J.Griffin,et?al.2013,Jong?Earn?Yu,et?al.2013,Meng?Zhang,et?al.2012,Seung?Hyuk?Choi,et?al.2011）。

近十年來，隨著我國海水魚類養殖產業的快速發展，由遲鈍愛德華氏菌引起的疾病在不同的海水魚類養殖品種中都有發現。中國水產科學研究院黃海水產研究所從患“脾腎結節癥”的大菱鲆脾臟和腎臟中分離到了一株優勢細菌，經過深入細致的病原學和病理學研究，證實大菱鲆“脾腎結節癥”的致病原是遲鈍愛德華氏菌（水產學報，2007年第31卷第4期），并深入進行了遲鈍愛德華氏菌和其他常見海水魚類病原菌的多重PCR檢測技術和熒光定量PCR檢測技術研究（劉智超，中國海洋大學碩士畢業論文，2012年）。同時，針對包括遲鈍愛德華氏菌在內的多種大菱鲆常見病原篩選了一種多效中草藥復方（國家發明專利ZL201010100782.8）。這些研究主要集中于遲鈍愛德華氏菌感染養殖大菱鲆發病的流行病學、病原學、病理學和防治技術等方面，并未涉及到遲鈍愛德華氏菌的長期保存技術研究。

因為遲鈍愛德華氏菌是魚類較為常見且致病力較強的病原菌，已被公認為水生經濟動物細菌性疾病病原學研究的模式物種之一。在深入研究了該菌的病原學特性和致病機理等方面后，國內外很多學者研究認為研制開發相應的疫苗是預防遲鈍愛德華氏菌病最有效的措施之一，而如何長期保藏具有生物學活性的遲鈍愛德華氏菌或其疫苗成為其中的關鍵技術環節。真空冷凍干燥技術是目前長期保藏微生物菌株并保存其活性最有效的技術方法，非常適宜用于遲鈍愛德華氏菌活菌株或疫苗的長久保存。然而，由于遲鈍愛德華氏菌自身的生物學特性、生境條件、營養需求、人工培養方法等有其特異性，很難借鑒其他微生物菌株的保存方法，因此尋找合適的真空冷凍干燥保護劑和凍干方法是實現遲鈍愛德華氏菌凍干長久保存必須解決的技術難題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種用于冷凍真空干燥保存遲鈍愛德華氏菌菌株的凍干保護劑和具體的凍干方法，能夠實現遲鈍愛德華氏菌在常溫下的長期保藏和保存活力，為深入開展遲鈍愛德華氏菌的相關研究提供技術支撐。

本發明采用如下技術方案予以實現：

一種遲鈍愛德華氏菌的真空冷凍干燥保護劑，它的組成成份為：脫脂乳粉、乳糖、海藻糖、維生素C、NaCl和無菌蒸餾水。

進一步，所述的遲鈍愛德華氏菌的真空冷凍干燥保護劑，它的組成成份及其終濃度為：脫脂乳粉50～150g/L，乳糖50～100g/L，海藻糖100g/L，維生素C?5～20g/L，NaCl?15g/L，溶劑為無菌蒸餾水。

一種所述的保護劑的配制方法為：將脫脂乳粉、乳糖和海藻糖溶于無菌NaCl溶液中，在106℃條件下濕熱滅菌30min，自然冷卻后配制成溶液A；將維生素C溶于無菌NaCl溶液中，并經0.22μm混合纖維素濾膜過濾后配制成溶液B；將配置好的溶液A和溶液B在無菌條件下混合，并振蕩均勻后配制成凍干保護劑溶液，其各成份的終濃度為脫脂乳粉50～150g/L、乳糖50～150g/L、海藻糖100g/L、維生素C?5～20g/L、NaCl?15g/L。

本發明還提供一種遲鈍愛德華氏菌的凍干方法。

本發明是按如下技術方案實現的：