[發明專利]一種分離和培養臍帶間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201310442644.1
• 申請日: 2013-09-25
• 公開（公告）號: CN104450609B
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發明（設計）人: 吳亮;商周春;劉聰;王全磊;陳杰;董國藝;葛玉萍;李靜
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司11285
• 代理人: 張廣育,姜建成

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，更具體而言屬于干細胞領域。

背景技術

干細胞是一類能夠自我更新和具有多向分化潛能的細胞，在組織工程和細胞治療中，具有廣泛的應用前景。干細胞可分為兩大類：胚胎干細胞和成體干細胞。

胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是一類高度未分化的細胞，具有全能性。但由于ESCs來源困難，且容易產生安全問題和倫理問題，極大的限制了ESCs的研究和應用。

成體干細胞(Adult Stem Cells)是一類存在于已經分化組織中的多潛能細胞，這類細胞能夠自我更新并且能夠特化形成組成該類型組織的細胞。間充質干細胞(MesenchymalStem Cells，MSCs)是成體干細胞中的一種，來源于中胚層。目前，MSCs的研究以骨髓來源的間充質干細胞(Bone Marrow MesenchymalStem Cells,BMSCs)為主。大量的研究表明，BMSCs可以向成骨、軟骨、脂肪、神經等多種組織細胞分化，在細胞治療中，具有廣泛的臨床應用前景。但人體骨髓中的BMSCs含量極其稀少，并隨著年齡的增加，骨髓中的BMSCs的數量、增殖和分化能力均有顯著的下降，而且BMSCs的取材操作會給受試者造成傷害。這使得MSCs的研究和應用，尤其是臨床應用，受到極大的限制。

近年的研究發現，臍帶中的沃頓膠體富含臍帶間充質干細胞(Umbilical Cord MesenchymalStem Cells,UC-MSCs)，且大量研究表明，UC-MSCs具有與BMSCs相似的干細胞特性——良好的自我更新和多向分化能力，免疫原性低等特點。臍帶作為分娩后的廢棄物，取材方便，不會對受試者產生影響，且沒有倫理限制。因此，臍帶來源的MSCs引起了人們的廣泛關注。

目前，用于分離UC-MSCs的酶消化法中，存在著許多缺陷。例如，有方法直接使用膠原酶或者使用胰酶和膠原酶分離UC-MSCs(如專利公開文本CN102321575A、CN102517251A和CN102533643A公開的方法)。沃頓膠體經過IV型膠原酶或者II型膠原酶和胰酶消化后，透明質酸無法被有效水解而殘留，導致消化液過于黏稠，需用大量PBS緩沖液進行稀釋或增加離心力和離心時間，很大程度上會造成大量UC-MSCs損失或損傷。也有方法(如專利公開文本CN102191229A公開的方法)將中性蛋白酶、膠原酶和透明質酸酶混合進行長時間的共消化，雖然可以充分水解沃頓膠體中的透明質酸，降低了消化液的黏性，但共消化期間膠原酶、中性蛋白酶會對暴露的UC-MSCs造成傷害，最終難以獲得大量活性好的UC-MSCs。另外，在一些方法(如專利公開文本CN102321575A、CN102660501A公開的方法)中，使用過多的臍帶組織進行UC-MSCs分離，導致其中許多組織都無法被充分消化而殘留，需要使用濾網進一步過濾，這不僅增加了實驗操作，而且組織塊消化需要使用大量的消化酶，增加了UC-MSCs分離成本。

現有技術需要解決部分或全部上述分離UC-MSCs的問題。

發明內容

本發明的方法中，先使用胰酶和IV型膠原酶的混合消化液對沃頓膠體的組織結構進行水解，再使用透明質酸酶對消化液中的透明質酸進行高效水解。這樣采用酶序消化的方法不僅可以解決沃頓膠體經過膠原酶、胰酶消化后，UC-MSCs難收集的問題，還可以解決沃頓膠體經過透明質酸酶、膠原酶和胰酶的長時間共消化后，UC-MSCs細胞活性不佳的問題。而且，在本發明的方法中，組織塊消化充分，增加了UC-MSCs的獲得量，可以減少臍帶組織的使用量，減少酶的使用量，降低UC-MSCs分離成本。

在第一方面，本發明提供了一種分離UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟：

1)將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合后孵育；

2)然后加入透明質酸酶后孵育。

在第二方面，本發明提供了一種分離和培養UC-MSCs的方法，具體包括如下步驟：

1)將臍帶組織碎塊與胰酶和IV型膠原酶混合后孵育；

2)然后加入透明質酸酶后孵育；

3)回收細胞并將其培養，獲得UC-MSCs。

在一個實施方案中，制備本發明第一和第二方面的方法的步驟1)中的臍帶組織碎塊通過如下方式制備：剔除臍帶的動脈和靜脈，用等滲緩沖液沖洗(例如用PBS緩沖液沖洗)，在鈍性分離或不分離沃頓膠體后制成組織碎塊。