[發明專利]歐美楊PdHSP70基因及其應用

有效

• 申請號: 201310441298.5
• 申請日: 2013-09-25
• 公開（公告）號: CN103451193A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 郭鵬;董燕
• 申請（專利權）人: 大連民族學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C12N15/82;C12N1/21;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種來自歐美楊（Populus?deltoides×Populus?nigra）的PdHSP70基因及其應用。

背景技術

歐美楊（Populus?deltoides×Populus?nigra）是中緯度地區最適合種植的短輪伐期工業用材集約經營樹種之一。近年來我國引進了許多優良的歐美楊無性系用于營造大面積的速生豐產林并取得很好的經濟和社會效益。但高鹽等限制了其進一步的推廣。因此，要將其引入高鹽缺水地區時，篩選和培育抗鹽的品系是前提。隨著分子生物學的發展，利用分子生物學技術研究歐美楊抗鹽分子機制已成為解決這一問題的重要途徑，目前已有多個基因被發現與提高楊樹的抗逆性有關。熱激蛋白（heat?shock?protein,HSP）作為轉錄因子在真核生物中普遍存在，在植物中參與種子成熟、花的發育、抗逆與抗病蟲的防衛反應。近年來多種植物的HSP基因被廣泛研究，但該基因在歐美楊的研究還未見報道。

發明內容

本發明為解決現有技術中存在的上述問題，提供歐美楊中一種與逆境相關的bZIP基因，該基因在歐美楊中克隆，是HSP基因家族的一員，命名為PdHSP70。其在抗鹽反應中具有重要作用。

本發明公開的歐美楊（Populus?deltoides×Populus?nigra）逆境相關基因PdHSP70，它具有如SEQ?ID?NO：3所示的堿基序列。其序列由1968個堿基組成，自5’端第1到第1948位殘基為該基因的開放閱讀框序列，其表達受到鹽脅迫的誘導。

本發明的另一方面在于公開上文所述基因，具有如SEQ?ID?NO：3所示的堿基序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且具有與SEQ?ID?NO：3編碼的蛋白具有相同活性的堿基序列；或者是與SEQ?ID?NO：3具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的堿基序列。

本發明的另一方面在于公開上文所述基因的擴增引物，具有如SEQ?ID?NO：1～2所示的堿基序列。

本發明的另一方面在于公開上文所述歐美楊（Populus?deltoides×Populus?nigra）的PdHSP70基因編碼的蛋白質，具有如SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸殘基序列，其是有656個氨基酸殘基組成的蛋白質。

本發明的另一方面在于公開上文所述蛋白質的衍生蛋白質，其特征在于：具有如SEQ?ID?NO：4所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ?ID?NO：4編碼的蛋白具有相同活性的氨基酸殘基序列。

本發明的另一方面在于公開含有上文所述基因的表達載體。本發明所提供的抗逆相關基因PdHSP70，使用一種可以引導外源基因在植物表達中的表達載體轉化植株，可獲得對干旱脅迫抗逆性增強的轉基因植株。優選的情況下，所述表達載體為質粒pCAMBIA1304。本發明的抗逆相關基因PdHSP70在構建到表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導性啟動子均可，同時必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。為了便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定和篩選，可以在構建載體時對載體進行加工，例如加入可選擇標記，通常可使用的標記是對抗生素抗性酶的基因和生物安全標記，也可以是GUS、GFP等可以產生顏色變化的酶或發光化合物的基因等。攜帶有本發明的逆境相關基因PdHSP70的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，用于培育抗鹽的植物品種。

本發明的另一方面在于公開一種含有本發明上文所述基因的細胞系。在優選的技術方案中，上文所述細胞系為大腸桿菌Top10細胞或農桿菌EH105細胞。

本發明的另一方面在于公開上文所述的基因在培育抗鹽植物中的應用。所轉化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。本發明實施例中列舉了農桿菌介導的擬南芥轉化方法，并獲得了轉基因植株，試驗結果有力的證明了轉PdHSP70基因擬南芥具備更強的耐鹽能力。

本發明的創新特征是：本發明成功的擴增了正堿性亮氨酸拉鏈(basic-domain?leucine-zipper，bZIP)轉錄因子PdHSP70基因，其可以顯著提高下游抗逆基因的表達進而可廣泛用于楊樹抗鹽品種的培育等領域。

附圖說明

圖1為PdHSP70基因的表達示意圖，其中：橫坐標為時間（0、2、4、6h），縱坐標為相對表達量，從圖示結果可以看到PdHSP70基因在鹽脅迫下表達量顯著提高，且在不同時間點表達量不一致。此結果證明PdHSP70基因在鹽脅迫被誘導表達。