[發(fā)明專利]一種保護(hù)細(xì)菌低溫凍融損傷的抗凍多肽及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310441148.4
• 申請(qǐng)日: 2013-09-25
• 公開（公告）號(hào): CN103467586A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪少蕓;邵彪;趙立娜;饒平凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/46
• 分類號(hào): C07K14/46;A01N1/02;C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗凍多肽，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶酶解魚源膠原蛋白制備的抗凍多肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

食品和醫(yī)藥產(chǎn)品在低溫儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中由于環(huán)境溫度的波動(dòng)變化而反復(fù)地遭受冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的問題越來越受到人們的關(guān)注。溫度的反復(fù)升降使冰晶不斷生長(zhǎng)、凍融和重結(jié)晶，嚴(yán)重破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)而失去產(chǎn)品應(yīng)有的品質(zhì)。世界范圍內(nèi)的科學(xué)家正面臨嚴(yán)肅的挑戰(zhàn)：如何控制冰晶生長(zhǎng)及重結(jié)晶，實(shí)現(xiàn)低溫冷鏈上的冰晶生長(zhǎng)控制，是制約眾多食品和醫(yī)藥產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵所在。?

抗凍蛋白,?也稱“冰結(jié)構(gòu)蛋白”，是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶的活性蛋白質(zhì)。抗凍蛋白由于其具有控制冰晶生長(zhǎng)、減少細(xì)胞損傷及保持產(chǎn)品原有組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和品質(zhì)的特點(diǎn)和突出意義而成為熱點(diǎn)研究主題。?同樣的研究還表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域而并不是整體蛋白質(zhì)在起作用，即使是純化了的抗凍蛋白，抗凍活性往往不高，仍然需要探究其活性域來進(jìn)一步提高抗凍效率。所以，如何獲得食品源的結(jié)構(gòu)緊湊的高活性抗凍多肽，就成為抗凍蛋白迫切的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種保護(hù)細(xì)菌低溫凍融損傷的抗凍多肽及其制備方法，突破了國(guó)內(nèi)外現(xiàn)存的抗凍蛋白（多肽）的研究思路和方法，克服從天然生物體中純化抗凍蛋白數(shù)量的局限性以及國(guó)際FDA組織對(duì)轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應(yīng)用中的安全性顧慮，獲得基于食品源的高效抗凍多肽，為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種保護(hù)細(xì)菌低溫凍融損傷的抗凍多肽的氨基酸序列為：Gly-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Ala–Gly-Ala-Arg-Gly-Ala-Asp-Gly。

制備如上所述的保護(hù)細(xì)菌低溫凍融損傷的抗凍多肽的方法，以魚源膠原蛋白為原料，采用堿性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，分離純化、冷凍干燥得到所述的保護(hù)細(xì)菌低溫凍融損傷的抗凍多肽。

所述的魚源膠原蛋白包括來自魚皮、魚鱗的魚源膠原蛋白。

酶解條件為：pH值為9.0，溫度為45℃，時(shí)間為30分鐘，酶與底物的質(zhì)量比為1:20。

所述的分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex?G-50凝膠色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為2mL/min，洗脫峰在225nm下進(jìn)行測(cè)量；收集具有最佳抗凍活性的峰，再用Sulfopropyl-Sepadex?C-25陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為NaCl濃度梯度為0-0.5?M的0.01mol/L?pH7.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min；收集具有最佳抗凍活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離，反相HPLC的分離條件是用體積分?jǐn)?shù)為10%-90%的乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為1mL/min，收集體積分?jǐn)?shù)為35%乙腈溶液處的洗脫峰。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明立足于抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于特異的肽鏈結(jié)構(gòu)域而不是整體蛋白質(zhì)在起作用的理論基礎(chǔ)，以來自于魚源膠原蛋白為原材料，著眼于通過堿性蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)域組成的活性多肽，而使抗凍活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明為開發(fā)基于食品源的抗凍多肽以及探索其在食品、醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是純化魚皮膠原蛋白抗凍多肽的?CLC－HPLC-C18色譜圖。

圖2是純化的特異性抗凍多肽對(duì)保加利亞乳酸桿菌的低溫保護(hù)作用；其中，圖中的?A、B分別表示空白保加利亞乳酸桿菌、添加0.5%（w/w）特異性抗凍多肽樣品的保加利亞乳酸桿菌生長(zhǎng)情況圖。

具體實(shí)施方式

明膠酶解條件的優(yōu)化