[發(fā)明專利]一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310440023.X
• 申請(qǐng)日: 2013-09-24
• 公開（公告）號(hào): CN103505739A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏娟;樊春海;金彩虹;何丹農(nóng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司
• 主分類號(hào): A61K47/46
• 分類號(hào): A61K47/46
• 代理公司: 上海東方易知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 31121
• 代理人: 唐莉莎

1.一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，將擴(kuò)增引物DNA組裝在納米材料的表面，加入環(huán)狀DNA擴(kuò)增模板以及其他擴(kuò)增混合物后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，所制備的產(chǎn)物為納米金表面延伸而得到的長(zhǎng)單鏈DNA從而用作新型抗腫瘤藥物載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，所述的納米材料為有著較好生物相容性的納米材料，具體為納米球、納米管、納米棒、脂質(zhì)體中的一種或其組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，所述的引物DNA為5^，端經(jīng)過(guò)修飾的單鏈DNA，具體為巰基修飾、或生物素修飾、或氨基修飾。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，所述的環(huán)狀DNA，制備過(guò)程如下：

（1）堿基數(shù)為60-210個(gè)堿基的長(zhǎng)單鏈預(yù)成環(huán)DNA，5^，端修飾，與其在兩端互補(bǔ)的一段靶序列DNA混合；

（2）高溫處理后，緩慢降至室溫，退火；

（3）加入連接酶進(jìn)行連接；

（4）連接酶高溫變性；

（5）加入聚合酶，將靶序列從閉合環(huán)DNA上剪切；

（6）聚合酶高溫變性；

（7）使用超濾管，離心法去除混合溶液中變性的酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，步驟（1）所述預(yù)成環(huán)DNA為5^，端磷酸基團(tuán)修飾；步驟（2）所述為90℃高溫變性1分鐘；步驟（3）所述連接酶可生成磷酸二酯鍵，可為T4?DNA連接酶，或E.coliDNA連接酶，連接條件為25℃,?16小時(shí)；步驟（4）所述連接酶在65℃，10分鐘變性處理；步驟（5）所述為加入具有3^，—5^，外切核酸酶活性的T4?DNA聚合酶，剪切條件為37℃水浴中24小時(shí)；步驟（6）所述為聚合酶在85℃，10分鐘變性處理；步驟（7）所述超濾管規(guī)格為30KDa，離心條件為4℃，10000rpm/min，5分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，所述的滾環(huán)擴(kuò)增過(guò)程，具體為：

（1）滾環(huán)擴(kuò)增混合物，混合均勻；

（2）置于水浴中擴(kuò)增；

（3）phi29聚合酶變性；

（4）離心洗滌去除未反應(yīng)物。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)制備抗腫瘤藥物載體的方法，其特征在于，步驟（1）所述的擴(kuò)增混合物為金-引物DNA、環(huán)DNA、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP），或標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸，如生物素（biotin）dNTP、異硫氰酸熒光素(FITC)-dNTP、花青類染料(Cy3、Cy5)-dNTP、放射性標(biāo)記-dNTP，phi29聚合酶（10U/??L，終濃度為1U/??L）、及10×phi29擴(kuò)增緩沖液，擴(kuò)增緩沖液終濃度為1×；步驟（2）所述擴(kuò)增條件是30℃水浴，?30-120分鐘；步驟（3）所述phi29聚合酶變性條件是85℃，10-30分鐘；步驟（4）所述離心條件為4℃，5000rpm/min，5-10?分鐘。