[發(fā)明專利]芥末成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310437149.1
• 申請(qǐng)日: 2013-09-23
• 公開（公告）號(hào): CN103571944A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹際娟;徐君怡;孫銘英;曹冬梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曹際娟;徐君怡;孫銘英;曹冬梅
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)技術(shù)方法領(lǐng)域，具體涉及一種芥末成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）引物、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

食物過敏醫(yī)學(xué)上也稱變態(tài)反應(yīng)，是指機(jī)體受抗原(包括半抗原)刺激后，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸同一種抗原后在體內(nèi)引起體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，由此導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體生理機(jī)能障礙。它是一種復(fù)發(fā)率很高的疾病，引起變態(tài)反應(yīng)的抗原被稱為變應(yīng)原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分會(huì)引起6％至8%的兒童和2%的成人的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的會(huì)危及生命。預(yù)包裝食品由于多是成分復(fù)雜的深加工產(chǎn)品，如果含有致敏原成分而又未能明確告之，就有可能引起過敏，危害消費(fèi)者的健康安全。目前大約有160多種食品致敏原，芥末為常見的致敏原之一。2003年以來，歐盟、美國、香港等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)相繼制定了預(yù)包裝食品致敏原標(biāo)識(shí)要求的法規(guī)，并已于2005年起陸續(xù)發(fā)布和實(shí)施，對(duì)我國食品出口貿(mào)易造成了明顯影響。由于目前我國在食品致敏原成分檢測(cè)方法領(lǐng)域技術(shù)薄弱，隨著越來越多國家和地區(qū)對(duì)食品致敏原成分標(biāo)識(shí)法規(guī)的全面實(shí)施，食品標(biāo)簽的致敏原成分標(biāo)識(shí)要求和符合性檢驗(yàn)將會(huì)成為我國食品出口貿(mào)易的重要障礙。

芥（mustard）是十字花科（Cruciferae）數(shù)種草本植物的統(tǒng)稱，或指其辣味種子所制成的調(diào)味品。主要品種是：白芥（Sinapis?alba，或黃芥），原產(chǎn)于地中海地區(qū)；棕芥（Brassica?juncea，或芥菜），原產(chǎn)于喜馬拉雅山區(qū)。

目前，致敏原成分檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、色譜質(zhì)譜法、表面等離子共振免疫法等。但是不同的方法的檢測(cè)限存在較大的區(qū)別，因此機(jī)構(gòu)之間、國家之間應(yīng)該采用一種檢測(cè)結(jié)果較為精確、重復(fù)性較好的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前較多國家所認(rèn)可的方法是酶聯(lián)免疫法。但是酶聯(lián)免疫法也受許多因素制約，如被測(cè)食品母體、檢測(cè)人員、試劑盒等。

隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的新型鑒定技術(shù)已日益得到廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP，Loop-mediated?Isothermal?Amplification）是在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種較理想的手段，LAMP引物包括兩個(gè)外引物和兩個(gè)內(nèi)引物，特異結(jié)合靶序列上的6個(gè)特異區(qū)域。內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c(與Fl區(qū)域互補(bǔ))和F2序列，內(nèi)引物BIP包含B1c(與B1區(qū)域互補(bǔ))和B2序列，外引物為F3和/或B3序列，本發(fā)明在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物BLP，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，具體LAMP的引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域信息見圖1。其特點(diǎn)是：①只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；②高特異性：采用六個(gè)區(qū)段，四條引物，擴(kuò)增特異性高，可以根據(jù)是否擴(kuò)增來判斷目標(biāo)基因的存在與否；③快速、高效擴(kuò)增：擴(kuò)增在不到1h即可完成，且產(chǎn)率高；④靈敏度高：擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少；⑤鑒定簡便：在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴(kuò)增與否；另外，它利用恒溫和低反應(yīng)溫度（63℃），減少細(xì)胞損傷，檢測(cè)人員實(shí)際操作非常簡便?？傮w而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴(kuò)增法，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測(cè)體系，在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、致敏原成份檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本項(xiàng)目擬在前期研究的基礎(chǔ)上，將LAMP檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于食品中過敏原成分芥末的檢測(cè)，針對(duì)芥末反轉(zhuǎn)錄酶RT基因，應(yīng)用六條特異引物在恒溫的條件下、簡易的設(shè)備中，僅用一小時(shí)左右有效的完成篩查任務(wù)，結(jié)果判斷簡單，既能節(jié)省時(shí)間，又可大大降低檢測(cè)成本，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，可作為傳統(tǒng)PCR方法的有益補(bǔ)充。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)方案為：通過考察并鎖定芥末成分靶基因，然后設(shè)計(jì)合成4套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1～24；，優(yōu)化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ?ID?NO.19～24；進(jìn)而確定了LAMP方法的技術(shù)參數(shù)，最后驗(yàn)證引物特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)芥末成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，其堿基序列為SEQ?ID?NO.19～24，如下：

F3：cggcctttac?taggaggt????（SEQ?ID?NO.19）

B3：ttcgagaatc?gagcaacg????（SEQ?ID?NO.20）