[發明專利]血漿腎素的質譜分析

有效

• 申請號: 201310436176.7
• 申請日: 2009-08-07
• 公開（公告）號: CN103743848A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: C·E·拜爾斯特姆;R·E·瑞茨;N·J·克拉克
• 申請（專利權）人: 奎斯特診斷投資公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

本申請是申請日為2009年8月7日、申請號為200980130208.2、題為“血漿腎素的質譜分析”的專利申請的分案申請。?

發明領域

本發明涉及腎素活性的測量。在一個具體方面，本發明涉及通過HPLC-質譜法測量血漿腎素活性的方法。?

發明背景?

下列發明背景的描述只是提供用來輔助理解本發明，并非承認描述或構成本發明的現有技術。?

如Fredline等Clin.Chem.45:659-664(1999)所述，腎素是通過腎小球旁細胞分泌到血液中的蛋白水解酶。腎素作用于血管緊張素原，生成被稱作血管緊張素1(Ang1)的十肽。Ang1被血管緊張素轉換酶進一步切割，形成被稱作血管緊張素2(Ang2)的八肽。Ang2刺激細胞生長、鈉的腎小管運輸和醛固酮釋放。Ang2是人最有效的血管加壓劑之一，并在血壓調控中起重要作用。Ang2由于其循環濃度非常低和半衰期極短而難于直接測量；比Ang2更穩定的Ang1為測量腎素-血管緊張素系統的狀態提供了更好的分析物。由Ang1的生成速率確定“血漿腎素活性”(PRA)被臨床用于高血壓的診斷和控制。?

確定PRA的經典方法是放射免疫測定(RIA)，參見Sealey,Clin.Chem.37:1811-1819(1991)；Shionoiri等,Horm?Res.37:171-175(1992)。典型的放射免疫測定通過在試管中同時制備一系列標準和未知的混合物而進行，各混合物包含相同濃度的標記抗原和特異性抗體。適當的反應時間后，通過多種技術中之一將標記抗原的抗體結合(B)部分與游離(F)部分分離。將標準品的B/F比作為未標記抗原濃度的函數作圖(標準曲線)，且通過將觀測到的B/F比與標準曲線進行比較來確定未知的抗原濃度。放射免疫測定法基于競爭性結合原理，且所用的抗體可進行與其它血漿蛋白如內源血管緊張素的非特異性結合。這種潛在的交?叉反應性可引起PRA的過高評價。另一個方法是在用RIA定量前利用HPLC從其它血管緊張素中分離Ang1(參見下列實例：Meng等,J.Am.Soc.Nephrol.6:1209-1215(1995)；Meng等,J.Chromatogr.21,614(1):19-25(1993)；Kohara等,Peptides12:1135-1141(1991))。已利用紫外光、熒光和質譜檢測發展了用于定量Ang1的這些HPLC法(參見下列實例：Klickstein等,Anal?Biochem120:146-150(1982)；Miyazaki等,JChromatogr.490:43-51(1989)和Fredline等,Clin.Chem.45:659-664(1999))。?

例如，Fredline等描述了利用HPLC-電噴霧-串聯質譜法進行血漿腎素活性的測量。在進行該測量中，Fredline等在水敏性酶抑制劑(即，苯甲基磺酰氟(PMSF))存在下溫育血漿樣本，并通過觀測具有(m/z)649的前體離子的碰撞誘導解離來測量溫育期間生成的血管緊張素1量。?

發明概述?

本發明提供了通過質譜法測量樣本中血管緊張素1的量和測量樣本中血漿腎素活性的方法，所述質譜法包括串聯質譜法。?

一方面，提供測量樣本中血管緊張素1的量的方法。該方法可包括：(a)電離樣本中的血管緊張素1，產生一種或更多種可由質譜法檢測的離子；(b)通過質譜法檢測血管緊張素1離子(一種或更多種)的量，其中該離子選自質/荷比為433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297±0.5的離子；以及(c)利用所檢測的血管緊張素1離子(一種或更多種)的量來測量樣本中血管緊張素1的量。在一些實施方式中，該方法的定量極限是小于或等于0.1ng/mL；如小于或等于0.05ng/mL；如約0.03ng/mL。在進一步的實施方式中，該方法包括通過高效液相色譜(HPLC)從樣本純化血管緊張素1。在一些實施方式中，該方法進一步包括用固相萃取柱純化樣本中的血管緊張素1。在其它實施方式中，通過與內標的比較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)的量關聯于樣本中血管緊張素1的量。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素1生成后的降解程度。?