[發明專利]檢測鴨MAPK1基因的熒光定量RT-PCR方法

有效

• 申請號: 201310435432.0
• 申請日: 2013-09-23
• 公開（公告）號: CN103882039A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 于圣青;曹守林;韓先干;王少輝;丁鏟;田明星
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海百一領御專利代理事務所(普通合伙) 31243
• 代理人: 馬育麟

1.鴨MAPK1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種克隆鴨MAPK1基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取鴨脾臟總RNA，反轉錄為cDNA；以cDNA為模板，MAPK1-AF和MAPK1-AR為引物，PCR擴增MAPK1基因；擴增產物回收后與pMD18-T載體連接、轉化、提取陽性克隆測序，測序結果與雞MAPK1序列進行比較，測序正確的質粒命名為pMD18-MAPK1；上游引物MAPK1-AF和下游引物MAPK1-AR的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示；

（2）提取鴨脾臟總RNA，用MAPK1-3GSP1和3’RACE?Outer?Primer進行Outer?PCR反應，MAPK1-3GSP2和3’RACE?Inner?Primer進行Inner?PCR反應，將回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化，選取疑似陽性克隆進行測序，測序結果與雞MAPK1序列進行比較，測序正確的質粒命名為3’-pMD18-MAPK1；MAPK1-3GSP1和MAPK1-3GSP2，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7和8所示，3’RACE?Outer?Primer和3’RACE?Inner?Primer核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9和10所示；

（3）提取鴨脾臟總RNA，用MAPK1-5GSP1（SEQ?ID?NO.11）和5’RACE?Outer?Primer（SEQ?ID?NO.13）進行Outer?PCR反應，MAPK1-5GSP2（SEQ?ID?NO.12）和5’RACE?Inner?Primer（SEQ?ID?NO.14）進行Inner?PCR反應，將回收的PCR產物與pMD18-T連接，轉化，選取疑似陽性克隆進行測序，測序結果與雞MAPK1序列進行比較，測序正確的質粒命名為5’-pMD18-MAPK1；MAPK1-5GSP1和MAPK1-5GSP2，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11和12所示，5’RACE?Outer?Primer和5’RACE?Inner?Primer的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.13和14所示；

（4）將pMD18-MAPK1、3’-pMD18-MAPK1和5’-pMD18-MAPK1質粒的測序結果進行拼接，得到鴨MAPK1的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.一種用于檢測鴨MAPK1基因的遺傳標記物，其特征在于，其核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.2所示的序列或其特異性片段。

4.用于擴增權利要求3所述遺傳標記物的引物。

5.如權利要求4所述引物，其特征在于，其上游引物MAPK1-TR-F和下游引物MAPK1-TR-R的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.3和4所示。

6.一種檢測鴨MAPK1基因的方法，其特征在于，提取鴨組織總RNA，反轉錄得到cDNA，以其為模板，利用SEQ?ID?NO.3和4所示的引物進行熒光定量PCR，根據擴增曲線判定結果。

7.如權利要求6所述的檢測鴨MAPK1基因的方法，其特征在于，實時熒光定量PCR的反應體系為：20μL反應體系的具體配置為：2×GoqPCR?Master?Mix10μL，上游引物MAPK1-TR-F和下游引物MAPK1-TR-R各0.5μL，cDNA1μL，去核酸水8μl。

8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應程序為：95℃10min；95℃變性15s，60℃退火1min，40個循環。

9.含有權利要求4或5所述引物的試劑盒。

10.權利要求9所述的試劑盒在檢測鴨MAPK1基因中的應用。