[發明專利]蝦成分的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201310433789.5
• 申請日: 2013-09-23
• 公開（公告）號: CN103468816A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 徐君怡;曹際娟;徐楊;史媛媛
• 申請（專利權）人: 徐君怡;曹際娟;徐楊;史媛媛
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于食品檢驗技術方法領域，具體涉及一種蝦成分環介導等溫擴增（LAMP）引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術

食物過敏醫學上也稱變態反應，是指機體受抗原(包括半抗原)刺激后，產生相應的抗體或致敏淋巴細胞，當再次接觸同一種抗原后在體內引起體液或細胞免疫反應，由此導致組織損傷或機體生理機能障礙。它是一種復發率很高的疾病，引起變態反應的抗原被稱為變應原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分會引起6％至8%的兒童和2%的成人的過敏反應，嚴重的會危及生命。預包裝食品由于多是成分復雜的深加工產品，如果含有致敏原成分而又未能明確告之，就有可能引起過敏，危害消費者的健康安全。目前大約有160多種食品致敏原，甲殼類動物為常見的致敏原之一。在可供食用的甲殼類動物中，最普遍為人類消費的是蝦。蝦也是最常見引起過敏反應的種類。2003年以來，歐盟、美國、香港等發達國家和地區相繼制定了預包裝食品致敏原標識要求的法規，并已于2005年起陸續發布和實施，對我國食品出口貿易造成了明顯影響。由于目前我國在食品致敏原成分檢測方法領域技術薄弱，隨著越來越多國家和地區對食品致敏原成分標識法規的全面實施，食品標簽的致敏原成分標識要求和符合性檢驗將會成為我國食品出口貿易的重要障礙。

蝦（shrimp）屬節肢動物門（Arthropoda）甲殼亞門(Crustacea)，種類很多，包括青蝦、河蝦、草蝦、小龍蝦、對蝦、明蝦、基圍蝦、琵琶蝦、龍蝦等。

目前，致敏原成分檢測方法主要有酶聯免疫法、聚合酶鏈式反應法、色譜質譜法、表面等離子共振免疫法等。但是不同的方法的檢測限存在較大的區別，因此機構之間、國家之間應該采用一種檢測結果較為精確、重復性較好的標準方法。目前較多國家所認可的方法是酶聯免疫法。但是酶聯免疫法也受許多因素制約，如被測食品母體、檢測人員、試劑盒等。隨著分子生物學理論和技術的快速發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為基礎的新型鑒定技術已日益得到廣泛應用。環介導等溫擴增法（LAMP，Loop-mediated?Isothermal?Amplification）是在PCR基礎上創建的一種較理想的手段，LAMP引物包括兩個外引物和兩個內引物，特異結合靶序列上的6個特異區域。內引物FIP包含F1c(與Fl區域互補)和F2序列，內引物BIP包含B1c(與B1區域互補)和B2序列，外引物為F3和/或B3序列，本發明在內外引物的基礎上引入環引物BLP，大大縮短了反應時間，具體LAMP的引物組成及對應區域信息見圖1。其特點是：①只需一恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性；②高特異性：采用六個區段，四條引物，擴增特異性高，可以根據是否擴增來判斷目標基因的存在與否；③快速、高效擴增：擴增在不到1h即可完成，且產率高；④靈敏度高：擴增模板可達10拷貝或更少；⑤鑒定簡便：在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物-焦磷酸鎂沉淀，可用肉眼觀察判斷擴增與否；另外，它利用恒溫和低反應溫度（63℃），減少細胞損傷，檢測人員實際操作非常簡便。總體而言，LAMP法是一種簡便、快速、高特異的基因擴增法，不需要特殊的試劑和儀器設備，采用該方法能建立起總成本低廉的檢測體系，在轉基因食品檢測、致敏原成份檢測等領域具有廣闊的應用前景。

本發明擬在前期研究的基礎上，將LAMP檢測技術應用于食品中過敏原成分蝦的檢測，針對蝦線粒體12S?rRNA基因，應用四條特異引物在恒溫的條件下、簡易的設備中，僅用一小時左右有效的完成篩查任務，結果判斷簡單，既能節省時間，又可大大降低檢測成本，適用于基層實驗室，可作為傳統PCR方法的有益補充。

發明內容

本發明的技術方案為：通過考察并鎖定南美白對蝦成分靶基因，然后設計合成4套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1～20；，優化體系，最后確定一套特異性LAMP引物，其堿基序列如SEQ?ID?NO.17～20；進而確定了LAMP方法的技術參數，最后驗證引物特異性、靈敏度、穩定性。本發明的具體技術方案如下：

本發明涉及一種檢測蝦成分的環介導等溫擴增引物，其堿基序列為SEQ?ID?NO.17～20，如下：

F3????tagaaaccga?cctggctc????????（SEQ?ID?NO.17）

B3????tcataagatt?aagttacttt?aggga????（SEQ?ID?NO.18）