[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)富含黃酮和多糖的雪蓮培養(yǎng)物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310432957.9
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103484422A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳泉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州市恩道生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/01;A01H4/00;C12R1/91
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 黃冠華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)雪蓮次生代謝產(chǎn)物的方法，具體地，涉及一種生產(chǎn)富含黃酮和多糖的雪蓮培養(yǎng)物的方法。

背景技術(shù)

雪蓮(Saussurea?medusa?Maxim)，是我國一種名貴植物藥材，產(chǎn)于我國甘肅、青海、西藏、新疆等地的高海拔山區(qū)的雪域之中，具有散寒除濕、壯陽補(bǔ)血、抗炎鎮(zhèn)痛等作用，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、陽萎、婦女月經(jīng)不調(diào)、高山不適應(yīng)癥等。藥理研究證明，雪蓮具有抗風(fēng)濕鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、終止妊娠、清除自由基及抗疲勞、解痙、降壓和平喘、抑制病毒復(fù)制、抑制染色體損傷、促進(jìn)輻射損傷修復(fù)、促創(chuàng)面愈合抗炎等作用。最近日本研究人員發(fā)現(xiàn)，從雪蓮提取的木質(zhì)體(lignan)類化合物，具有抗HIV、抗腫瘤和降血壓的作用。在新疆，雪蓮藥材每年的需求量在百噸以上，而天然雪蓮資源已經(jīng)嚴(yán)重匱乏，人工栽培還未成功，造成雪蓮藥材嚴(yán)重供不應(yīng)求。為保護(hù)國家珍稀植物，中國已在2001年明令禁止采挖天然雪蓮、肉蓯蓉等植物，更造成了雪蓮藥材的短缺。

野生雪蓮中有效成分—多糖類化合物含量低，通常只有干重的0.7%左右。為此，迫切需要解決藥用雪蓮資源問題。然而，通過人工培育解決雪蓮資源問題是一種有效的途徑，可是目前尚未見到有關(guān)用細(xì)胞培養(yǎng)高產(chǎn)雪蓮多糖類化合物這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。

中國發(fā)明專利申請（公開號CN1340611A，公開日2002年03月20日，申請?zhí)?0123740.3）公開了一種水母雪蓮高產(chǎn)黃酮細(xì)胞系，用本發(fā)明提供的細(xì)胞系和培養(yǎng)基，其細(xì)胞生長速率為35～40g干重/升/月，黃酮類化合物的含量為培養(yǎng)物干重的6～7%，雖然具有較好的細(xì)胞生長特性和較高的生物合成黃酮的能力，但仍存在以下不足：(1)黃酮含量還較低；(2)細(xì)胞聚集培養(yǎng)尺寸大于Smm就可能導(dǎo)致黃酮含量的下降；(3)細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性較差。

中國發(fā)明專利申請（公開號CN1424395A，公開日2003年06年18日，申請?zhí)?2156868.5）公開了一種建立穩(wěn)定高產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物黃酮的雪蓮細(xì)胞系的方法，其利用60Co-γ射線照射、紫外光線照射等手段誘變處理原始雪蓮細(xì)胞系，以提高雪蓮細(xì)胞中黃酮的含量，獲得了一株穩(wěn)定高產(chǎn)雪蓮細(xì)胞系，可連續(xù)傳代50代，細(xì)胞的培養(yǎng)密度和黃酮含量一直維持在20g(干重)/L和12%左右，該細(xì)胞系適應(yīng)能力強(qiáng)，可以在18℃～30℃環(huán)境中生長，最適培養(yǎng)溫度范圍為20℃～25℃，但是該專利文獻(xiàn)未說明細(xì)胞聚集生長對黃酮合成的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種生產(chǎn)富含黃酮和多糖的雪蓮培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明可穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)含黃酮和多糖等雪蓮次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，不受自然條件的影響。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，一種富含黃酮和多糖的雪蓮培養(yǎng)物的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：

步驟（1），雪蓮種子經(jīng)過萌發(fā)獲得雪蓮植株，將所述雪蓮植株作為外植體，先用自來水沖洗，然后用殺菌劑浸泡殺菌，再用無菌水沖洗，然后接種于含植物激素的1/2MS培養(yǎng)基上24～26℃培養(yǎng)，經(jīng)12～15d培養(yǎng)后，即可在外植體的切口部位形成愈傷組織，將所述愈傷組織在基本培養(yǎng)基上經(jīng)過繼代培養(yǎng)，每12～15d轉(zhuǎn)代一次，選取淺紅色愈傷組織的細(xì)胞系為高產(chǎn)雪蓮黃酮和多糖的細(xì)胞系；

步驟（2），將所述細(xì)胞系在添加秋水仙堿的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得雪蓮多倍體細(xì)胞系；

步驟（3），將所述雪蓮多倍體細(xì)胞系接種于合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到富含雪蓮黃酮和多糖的細(xì)胞，即得。

優(yōu)選的，步驟（1）中，所述1/2MS培養(yǎng)基上24～26℃培養(yǎng)為無光照的暗培養(yǎng)。

更優(yōu)選的，步驟（1）中，所述無菌水沖洗的次數(shù)為5～6次，每次2～3分鐘。

更優(yōu)選的，步驟（1）中，所述植物激素為生長素和/或細(xì)胞分裂素，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述生長素為2,4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸，所述細(xì)胞分裂素為6-芐基腺嘌呤或激動(dòng)素。

更優(yōu)選的，步驟（2）和步驟（3）之間還包括以下步驟：將所述雪蓮多倍體細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

在本發(fā)明中，在有光照條件下可以獲得雪蓮高產(chǎn)多糖細(xì)胞系，但是在暗培養(yǎng)條件下，獲得的雪蓮高產(chǎn)多糖細(xì)胞系效果更好。

本發(fā)明的雪蓮細(xì)胞系具有以下特征：顏色為粉紅色，結(jié)構(gòu)緊密，黃酮含量為細(xì)胞干重的15～20%左右，細(xì)胞聚集生長的大小為5～30mm，細(xì)胞的培養(yǎng)密度可達(dá)23～25g（干重）/L培養(yǎng)基，黃酮產(chǎn)量一般為2.5～3.Og/L培養(yǎng)基，該細(xì)胞系可用于制各中藥原料藥雪蓮黃酮和多糖等雪蓮次生代謝產(chǎn)物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：