[發明專利]一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產L-苯丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201310432381.6
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103484508A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 張懷;楊園園
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: C12P13/22
• 分類號: C12P13/22;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

技術領域：

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種大腸桿菌加強檸檬酸或檸檬酸鹽吸收調控L-苯丙氨酸合成的方法。

技術背景：

芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，只能由微生物和植物經莽草酸途徑合成。L-苯丙氨酸作為人體必需氨基酸，是氨基酸輸液和氨基酸飲膳所必須的成分，也是用于商業生產上的重要氨基酸。其中L-苯丙氨酸目前最主要的用途是合成阿斯巴甜（天冬氨酰苯丙氨酸甲酯），在其消費構成中約占90%。阿斯巴甜已在全球100多個國家和地區獲準使用，應用于6000多種飲料、食品和醫藥等產品中，對于L-苯丙氨酸年需求量已超過1.5萬噸。

大腸桿菌作為基因工程的重要宿主，其遺傳背景清楚，經過代謝改造已成為發酵生產苯丙氨酸的主要方法。目前研究L-苯丙氨酸生產菌株代謝改造許多都是增加PEP和E4P的供給，將代謝流導向DAHP，提高產量。苯丙氨酸的生成大量消耗PEP，減少PEP生成草酰乙酸的代謝流，從而影響大腸桿菌的三羧酸循環與菌體生長，最終影響苯丙氨酸的生成量。如何讓大腸桿菌在培養基中有效吸收利用檸檬酸，增強三羧酸循環，可提高循環過程中草酰乙酸的生成，草酰乙酸與乙酰輔酶A通過縮合反應有效將代謝流導入三羧酸循環，同時減少乙酰輔酶A生成乙酸流量，有利于苯丙氨酸的合成。

發明內容

本發明擬對大腸桿菌導入檸檬酸轉運蛋白基因citT基因，加強檸檬酸吸收調控苯丙氨酸合成。在大腸桿菌以葡萄糖為碳源發酵生產苯丙氨酸的過程中，當苯丙氨酸大量生成時，大部分前體物質PEP流向苯丙氨酸代謝途徑，PEP向三羧酸循環流量減少，這樣直接導致草酰乙酸量減少，同時葡萄糖吸收過程中會產生大量丙酮酸，丙酮酸進一步轉化乙酰輔酶A，草酰乙酸量的大量減少使得與乙酰輔酶A的縮合反應減緩，在生長的一定階段會使得乙酰輔酶A積累，并轉化為乙酸，乙酸作為一種副產物會限制菌體生長和目的產物合成。若大腸桿菌利用外加的檸檬酸可加強三羧酸循環，從而提高循環過程中草酰乙酸的生成，使得草酰乙酸的與乙酰輔酶A通過縮合反應有效將代謝流導入三羧酸循環，同時減少乙酰輔酶A生成乙酸流量，有利于苯丙氨酸的合成。但大腸桿菌在好氧條件下并不能從細胞外吸收檸檬酸而加以利用。本發明擬通過基因改造，使得大腸桿菌組成性表達檸檬酸轉運蛋白基因citT基因，可在好氧條件下吸收檸檬酸或檸檬酸鹽，加強三羧酸循環反應，從而提高苯丙氨酸產量。

一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產L-苯丙氨酸的方法：采用大腸桿菌citT基因，并在citT基因上游加上組成性啟動子，連接至L-苯丙氨酸工程載體中，形成構建質粒，最后將所述構建質粒導入大腸桿菌中，組成性表達citT基因，在培養基中添加檸檬酸或檸檬酸鹽，發酵生產苯丙氨酸。

該方法包括以下幾個步驟：

（1）：采用大腸桿菌citT基因并在citT基因上游采用組成性表達啟動子，連接至L-苯丙氨酸工程載體中，形成構建質粒，所構建的質粒為包含citT基因的質粒。citT基因及上游啟動子可采用已知的實驗方法獲得，包括但不限于化學合成或PCR（聚合酶鏈式反應）；質粒構建可采用已知的實驗方法進行。

（2）：將所構建的含有citT基因的質粒導入大腸桿菌中，在培養基中添加檸檬酸或檸檬酸鹽發酵生產苯丙氨酸，檸檬酸或檸檬酸鹽濃度范圍為大于0g/L小于30g/L。

本發明具有以下有益效果：

含有citT基因的構建質粒通過組成性表達檸檬酸轉運蛋白citT基因，可以在好氧條件下吸收檸檬酸，在培養基中添加廉價易得的檸檬酸或檸檬酸鹽，大腸桿菌通過三羧酸循環反應生成草酰乙酸，避免乙酸過量積累，同時強化三羧酸循環可為菌體生長提供能量，有利于生產苯丙氨酸。

附圖說明

圖1為大腸桿菌苯丙氨酸的合成代謝途徑：G6P：6-磷酸葡萄糖；PYR：丙酮酸；PEP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：赤蘚糖-4-磷酸；DAHP：3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸；OAA：草酰乙酸；AcoA：乙酰輔酶A；CIT：檸檬酸；TCA：三羧酸循環；pck：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；ppc：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pykA：丙酮酸激酶II；pykF：丙酮酸激酶I

具體實施方式：

步驟一：含citT基因的質粒構建，具體方法如下：

（1）擴增citT基因

根據NCBI公布大腸桿菌的基因組序列，設計citT基因擴增引物如下，并委托生物工程（上海）有限公司利用DNA合成儀合成：

CitF1:GGAAGCTAAAATGTCTTTAGCAAAAGATAATA