[發(fā)明專利]一種纖維素酶的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310431838.1
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103740675A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶向紅;馬明;劉付燕
• 申請（專利權(quán)）人: 明博醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)(上海)有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/885;C12R1/685
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種纖維素酶的生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著石化燃料由短缺變枯竭，能源是人類面臨的共同問題。尋找新的能源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。纖維素與石化燃料不同，它是一種可再生的資源。地球上每年光合作用可產(chǎn)生大于100億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素。纖維素是一種多糖，在纖維素酶的催化條件下可分解產(chǎn)生二糖或葡萄糖，再發(fā)酵產(chǎn)生乙醇等能源物質(zhì)。

可惜的是纖維素的利用目前尚未完全開發(fā)，造成資源的巨大浪費(fèi)。為了更好地利用纖維素，愈來愈多的國外學(xué)者開始關(guān)注纖維素酶的研究，然而，纖維素酶降解纖維素機(jī)理復(fù)雜，對酶的活性要求較高，因此致使燃料乙醇生產(chǎn)成本非常高，還不能廣泛應(yīng)用。纖維素乙醇發(fā)酵領(lǐng)域的十幾個(gè)中國專利的內(nèi)容都集中在糖化環(huán)節(jié)的開發(fā)方面，沒有酶方面的專利，因此在實(shí)現(xiàn)纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，需要引進(jìn)由國外專利控制的酶。因此，開發(fā)具有我國獨(dú)立的自主知識產(chǎn)權(quán)的技術(shù)，是促進(jìn)我國燃料乙醇工業(yè)快速發(fā)展的關(guān)鍵。

目前，纖維素酶的生產(chǎn)有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方法。固體發(fā)酵法是以玉米等農(nóng)作物秸稈為主要原料，以單一菌種作為發(fā)酵菌種，其投資少、工藝簡單、產(chǎn)品價(jià)格低廉，目前國內(nèi)絕大多數(shù)纖維素酶生產(chǎn)廠家均采用該技術(shù)生產(chǎn)纖維素酶。然而傳統(tǒng)的固體發(fā)酵法存在根本上的缺陷：(1)玉米等農(nóng)作物秸稈這些天然纖維素原料是水不溶性的，在培養(yǎng)過程中不能直接被發(fā)酵菌種細(xì)胞吸收而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)纖維素酶的合成；(2)纖維素酶誘導(dǎo)物只能由發(fā)酵菌株本身適應(yīng)環(huán)境后發(fā)酵產(chǎn)生，產(chǎn)酶效率低下；(3)菌種發(fā)酵基質(zhì)的營養(yǎng)成分主要靠外來添加，操作復(fù)雜，成本較高；(4)單一菌種發(fā)酵，產(chǎn)酶效率低，酶系不完全。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種旨在克服傳統(tǒng)的固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的缺點(diǎn)，利用細(xì)菌和霉菌兩段發(fā)酵金針菇菌糠生產(chǎn)纖維素酶的方法。

本發(fā)明是通過如下方式來實(shí)現(xiàn)的：

一種纖維素酶的生產(chǎn)方法，其特征是采用乳酸菌和復(fù)合霉菌兩段發(fā)酵金針菇菌糠生產(chǎn)纖維素酶，其中第一段首先接種乳酸菌，乳酸菌發(fā)酵金針菇菌糠作為第二段復(fù)合霉菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的營養(yǎng)成分和纖維素酶誘導(dǎo)物來源；第二段在乳酸菌發(fā)酵過的底物上再接種復(fù)合霉菌，乳酸菌和復(fù)合霉菌共培養(yǎng)，兩種霉菌協(xié)同互補(bǔ)，從而最終高效率地制得低成本、高活性、酶系完全的纖維素酶。

一種纖維素酶的生產(chǎn)方法，其具體的步驟如下：

(1)分別將乳酸菌，綠色木霉和黑曲霉各自進(jìn)行活化、逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成菌液，其中兩種霉菌制備成復(fù)合霉菌制劑；

(2)將金針菇采收后的無污染的新鮮金針菇菌糠，加入麩皮，充分混合均勻，調(diào)整水分含量最終為40-50％；

(3)在(2)處理過的金針菇菌糠中接種(1)制備的乳酸菌液，接種量為混合物干重的0.1-0.3％，充分?jǐn)嚢?，使微生物和金針菇菌糠充分接觸；

(4)將(3)獲得的混合物放于水泥筑成的發(fā)酵池或簡易發(fā)酵池中，發(fā)酵池深度為45-65cm，以塑料薄膜密封發(fā)酵池，在25-32℃保溫，厭氧發(fā)酵3-5d；

(5)向(4)制得的基質(zhì)中加入(1)制備的復(fù)合霉菌制劑，接種量為混合物干重的1-2％，在25-35℃保溫，每天翻轉(zhuǎn)發(fā)酵物一次，好氧發(fā)酵3-5d，烘干，粉碎至3目。

纖維素酶的具體生產(chǎn)步驟(2)，其特征是以金針菇菌糠作為最初的底物，這使得生產(chǎn)成本顯著降低。

纖維素酶的具體生產(chǎn)步驟(3)(4)，其特征是首先由乳酸菌發(fā)酵金針菇菌糠，這樣不僅積累了豐富的營養(yǎng)成分而且將大分子的不溶于水的纖維素降解為了小分子的水溶性的纖維二糖等，使金針菇菌糠成為一種富含營養(yǎng)成分和纖維素酶誘導(dǎo)物的優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基。

纖維素酶的具體生產(chǎn)步驟(5)，其特征是復(fù)合霉菌制劑由綠色木霉和黑曲霉組成，按照綠色木霉：黑曲霉=0.8-1.5的比例復(fù)配培養(yǎng)，協(xié)同互補(bǔ)，這樣可以避免產(chǎn)酶過程中的反饋抑制作用，誘導(dǎo)纖維素酶大量產(chǎn)生，得到酶系完全、酶活性高的纖維素酶。

纖維素酶的具體生產(chǎn)步驟(5)，其特征是乳酸菌和復(fù)合霉菌共培養(yǎng)，乳酸菌只負(fù)責(zé)營養(yǎng)成分和纖維素誘導(dǎo)物的供應(yīng)，復(fù)合霉菌只負(fù)責(zé)產(chǎn)纖維素酶，兩者分工進(jìn)行，從而使纖維素酶的生產(chǎn)效率大大提高。

按照纖維素酶的生產(chǎn)步驟制得的纖維素酶為淡黃色固體粉末，活力達(dá)到平均572U/g，氣味為醇香和酸味。