[發明專利]一種從大腸桿菌細胞中區分可溶性及不溶性蛋白質的方法

有效

• 申請號: 201310431724.7
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103467564A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 聞崇煒;王亞麗
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12N1/06;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

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技術領域

本發明涉及生物、醫藥及食品工業技術領域，更具體涉及一種從大腸桿菌細胞中制備可溶性蛋白質及不溶性蛋白質的方法。

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背景技術

大腸桿菌是當前基因工程中最常用的宿主菌之一，可以表達生產重組胰島素、生長激素、干擾素、表皮生長因子等多種極具醫藥價值的活性蛋白質產品。這些重組蛋白質產物在大腸桿菌細胞內既可能以可溶性方式存在，也可能以不溶性方式存在。因此，在大規模制備重組蛋白質之前首先必須對大腸桿菌細胞進行破碎處理。

大腸桿菌細胞壁的最外層為厚約8-10nm的脂多糖層，內層為肽聚糖層，這一結構使大腸桿菌具備較強的抗拉伸和抗剪切能力。因此，采用較溫和的酶法、化學滲透法、凍融法等方法，對大腸桿菌細胞的破碎效率均不高，導致細胞內的蛋白質釋放不完全。借助珠磨破碎機和高壓勻漿機等專用設備處理大腸桿菌細胞，可以得到較好的破碎效率，但是設備價格較高，能耗較高，破碎過程中還伴有高溫、高噪音、高剪切力。因此，能否開發出簡便高效溫和的破碎大腸桿菌細胞的工藝，進而區分出可溶性及不溶性蛋白質，成為提取重組蛋白質產物的關鍵性步驟。

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發明內容

本發明的目的是提供一種從大腸桿菌細胞中區分可溶性及不溶性蛋白質的方法。該方法所述工藝操作簡便，無特殊設備要求，易于放大規模，可以使大腸桿菌細胞的破碎率達到98.9%以上，收集上清與沉淀可以分別得到大腸桿菌中的可溶性蛋白與不溶性蛋白質。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施：?

（1）室溫下將大腸桿菌菌液離心，收取大腸桿菌菌體，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液（50mM?Tris·Cl，100mM?NaCl，pH?8.0）的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；

（2）向所得重懸菌液中加入Triton?X-100，至Triton?X-100的最終體積濃度達到0.5%～5%，混勻后于4℃靜置過夜，8000rpm離心10min，分別收集上清液與菌體沉淀；

（3）向所得菌體沉淀中按照每克濕重用100ml高滲緩沖液（20mM?Tris·Cl，2.5mM?EDTA，200g/L蔗糖，pH?8.0）的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，棄去高滲緩沖液，保留所得菌體沉淀；

（4）向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克濕重用100ml低滲緩沖液（20mM?Tris·Cl，2.5mM?EDTA，pH?8.0）的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集低滲緩沖液處理后所得上清液，同時收集菌體沉淀；????

（5）向步驟4所得菌體沉淀繼續按照步驟3、步驟4所述實驗流程用高滲緩沖液與低滲緩沖液重復處理2次，可以使大腸桿菌細胞總體破碎率達到98.9%以上，合并Triton?X-100處理后及低滲緩沖液處理后所得上清液即得大腸桿菌細胞內可溶性蛋白質，收集最后一次低滲緩沖液處理后所得沉淀即得大腸桿菌細胞內不溶性蛋白質。

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本發明具有以下優點：

1?本發明所用工藝操作簡單易行，無需使用任何昂貴破菌儀器和設備，成本低廉，易于放大生產規模，有較好的應用潛力和實際應用價值；

2?本發明所用分離步驟中無相變發生，有利于保護所需分離蛋白質產物的生物學活性。

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附圖說明

圖1為一種從大腸桿菌細胞中區分可溶性及不溶性蛋白質的方法的方框示意圖。

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具體實施方式

以下通過實施例對本發明做進一步的描述：

實施例1

配制足量重懸緩沖液（50mM?Tris·Cl，100mM?NaCl，pH?8.0）、高滲緩沖液（20mM?Tris·Cl，2.5mM?EDTA，200g/L蔗糖，pH?8.0）及低滲緩沖液（20mM?Tris·Cl，2.5mM?EDTA，pH?8.0）；

室溫下離心大腸桿菌菌液，收取大腸桿菌菌體60毫克，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；向所得重懸菌液中加入Triton?X-100，至Triton?X-100最終濃度達到0.5%，混勻后于4℃靜置過夜，再以8000rpm離心10min，分別收集上清液與菌體沉淀；