[發明專利]利用高分辨熔解曲線分析技術檢測PAH基因突變的方法

無效

• 申請號: 201310431132.5
• 申請日: 2013-09-22
• 公開（公告）號: CN103509865A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 張奕;傅詠南;王校;毛丹丹;卞雪蓮
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine?hydroxylase,?PAH)?基因定位于染色體12q23.2，全長約90kb，包括13個外顯子和12個內含子。外顯子長為1353bp的單鏈，mRNA翻譯成含451個氨基酸的酶單體，單體聚合成有功能的PAH?酶。PAH基因突變可導致肝臟苯丙氨酸羥化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常轉化為酪氨酸，從而在肝臟中代謝紊亂，導致患兒出現苯丙酮尿癥(phenylketonuria,?PKU)。苯丙酮尿癥是一種氨基酸代謝異常的常染色體隱性遺傳病。在歐美地區的發病率為1/10000，在我國是1/16000，雜合子頻率為1/50。

迄今已經發現PKU?有560多種突變，其中60%為錯義突變，致病突變大多位于外顯子或內含子與外顯子的交接區，嚴重影響苯丙氨酸羥化酶基因轉錄和翻譯及蛋白質的異常折疊、聚合，使其加速降解，從而影響苯丙氨酸羥化酶的催化活性。在不同種族和地區人群之間苯丙氨酸羥化酶基因座突變部位及分布具有較大差異。歐洲PKU?患者的常見突變位于外顯子12?的R408Q?(31?%)；中國人群PKU?患者最常見的突變為R243Q、V399V、Ex6-96A>G、R111X、R413P和Y356X等，集中于PAH基因第3、6、7、11和12外顯子區域，突變發生頻率可達80%。苯丙氨酸羥化酶基因常見突變的研究有利于建立苯丙酮尿癥的基因診斷，以便于實現苯丙酮尿癥的早期診斷和產前診斷。

目前普遍應用的突變檢測方法為DNA直接測序法，PCR產物直接進行DNA序列分析，可以明確突變位點，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用于對大量樣本進行檢測等缺點。

本發明應用一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法——高分辨熔解曲線（High?resolution?melting，HRM）分析技術。其原理是根據DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，飽和性熒光染料高濃度占據雙鏈DNA所有堿基對，當雙鏈DNA局部解鏈時，熒光染料釋放，熒光強度的降低精準可靠地反映出DNA分子的解鏈情況。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失。該方法與其他遺傳分型技術相比，操作簡單，具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點，結果準確，且實現了真正的閉管操作。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡單易行的苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明提供一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測PAH基因突變的方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：?采用硅膠吸附法抽提被測者口腔上皮細胞/外周血細胞樣本的基因組DNA，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，待測樣本濃度標化到10ng/ul；正常人樣本DNA為陰性對照。

第二步：根據PAH基因的保守區域，采用在線軟件Primer?3設計PAH基因第3、6、7、11和12外顯子HRM引物，確定最佳引物為18-25bp大小，PCR產物長度180-300bp。相關引物信息如下：

PAH基因外顯子3引物序列：

PAH-E3-F??5′-ccctccccattctctcttct-3′

PAH-E3-R??5′-gacagtgtggagttacttatgttgc-3′

PAH基因外顯子6引物序列：

PAH-E6-F??5′-gccctgcttgagacacctat-3′

PAH-E6-R??5′-TCTGCAGGAAcTGAGAAACG-3′

PAH基因外顯子7引物序列：

PAH-E7-F??5′-ttcttttcatcccagCTTGC-3′

PAH-E7-R??5′-aaaagatggcgctcattgtg-3′

PAH基因外顯子11引物序列：

PAH-E11-F??5′-cttttcacttggggcctaca-3′

PAH-E11-R??5′-agtggctcacctttgtcacc-3′

PAH基因外顯子12引物序列：

PAH-E12-F??5′-ccttcactcaagcctgtggt-3′

PAH-E12-R??5′-aaccgagtggcctcgtaag-3′