[發明專利]一種蛋白激酶的活性檢測方法及其抑制劑篩選方法

在審

• 申請號: 201310430041.X
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN104450867A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 魏世英;匡海門;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 匡海門
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/48
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種RIP3蛋白激酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法包括以下步驟：

（1）配制反應緩沖液，所得反應緩沖液的pH值為6.5～7.0，在該反應緩沖液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘堿性蛋白，待測RIP3蛋白激酶抑制劑，之后加入ATP，從而配制成反應體系溶液，該反應體系溶液中髓鞘堿性蛋白濃度為15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶濃度為5U/μl，ATP濃度為10μM～20μM，震蕩或靜置條件下進行反應，反應溫度為20℃～30℃，反應時間為60～90分鐘；

（2）檢測步驟（1）所得反應體系溶液中ATP的濃度，根據ATP的濃度計算RIP3蛋白激酶抑制劑的抑制率。

2.如權利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟（1）所述反應緩沖液的組分為：3-(N-嗎啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl₂2.5mM～5mM，MnCl₂2.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸鹽2.5mM～5mM和二硫蘇糖醇0.02mM～0.1mM。

3.如權利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟（2）所述根據ATP的濃度計算RIP3蛋白激酶抑制劑的抑制率的方法包括以下步驟：反應結束后加入熒光素和熒光素酶并檢測特異性反應率，將加入待測RIP3蛋白激酶抑制劑的加藥組特異性反應率與未加入待測RIP3蛋白激酶抑制劑的空白組特異性反應率相比較，待測RIP3蛋白激酶抑制劑的抑制率%=（空白組特異性反應率-加藥組特異性反應率）/空白組特異性反應率×100%。

4.如權利要求1所述的RIP3蛋白激酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，步驟（1）所述反應緩沖液的pH值為7.0，反應溫度為25℃，震蕩的速度為50～100RPM，反應時間為75分鐘。

5.一種RIP3蛋白激酶抑制劑篩選試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括RIP3蛋白激酶、髓鞘堿性蛋白、反應緩沖液、熒光素和熒光素酶。

6.如權利要求5所述RIP3蛋白激酶抑制劑篩選試劑盒，其特征在于，其中所述反應緩沖液組分為：3-(N-嗎啉基）丙磺酸10mM，MgCl₂5mM，MnCl₂2.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸鹽2.5mM，二硫蘇糖醇0.05mM，所述反應緩沖液pH值為7.0。

7.一種RIP3蛋白激酶活性的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

（1）配制反應緩沖液，所得反應緩沖液的pH值為6.5～7.0，在該反應緩沖液中加入待測RIP3蛋白激酶和/或髓鞘堿性蛋白，之后加入ATP，從而配制成反應體系溶液，該反應體系溶液中髓鞘堿性蛋白濃度為15ng/μl～30ng/μl，ATP濃度為10μM～20μM，震蕩或靜置條件下進行反應，反應溫度為20℃～30℃，反應時間為60～90分鐘；

（2）檢測步驟（1）所得反應體系溶液中ATP的濃度，根據ATP的濃度計算RIP3蛋白激酶的活性。

8.如權利要求7所述RIP3蛋白激酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟（1）所述反應緩沖液的組分為：3-(N-嗎啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl₂2.5mM～5mM，MnCl₂2.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸鹽2.5mM～5mM和二硫蘇糖醇0.02mM～0.1mM。

9.如權利要求7所述RIP3蛋白激酶活性的檢測方法，其特征在于，步驟（2）所述根據ATP的濃度計算RIP3蛋白激酶的活性的方法包括以下步驟：反應結束后加入熒光素和熒光素酶并檢測發光值，將加入髓鞘堿性蛋白的反應組發光值與未加入髓鞘堿性蛋白的空白組發光值相比較，RIP3蛋白激酶活性的特異性反應率=（空白組發光值-反應組發光值）/空白組發光值×100%。

10.威羅菲尼或索拉菲尼在制備RIP3蛋白激酶抑制劑中的用途。