[發明專利]用于與BRAF基因雜交的DNA探針庫及采用其富集BRAF基因片段的方法

有效

• 申請號: 201310429789.8
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103667268A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 邵陽
• 申請（專利權）人: 邵陽
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B40/06;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;張偉

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，具體而言，本發明涉及一種BRAF基因片段的富集和提取方法，所述方法可以精準地富集BRAF基因片段，進而可以選擇性地進行BRAF基因結構突變的檢測。?

背景技術

DNA測序技術正處在天翻地覆的劇變中，其突出特點為同時對眾多的位點進行觀察分析（大規模平行），從而逐步實現測序通量的大幅增長，原始數據中每個堿基的測序成本的急劇下跌。基于此，以前高不可攀的奢侈性活動（如個人基因測序、宏基因組學研究），逐漸變得越來越切實可行。特別是隨著科學的發展，由于傳統的Sanger測序已經不能完全滿足研究的需要，下一代測序技術（第二代測序技術，Next-generation?sequencing）應運而生。?

下一代測序技術是同步化三磷酸核苷酸的洗脫方法和同步化的光學檢測方法的結合。例如采用以魯米那（Illumina）提供的儀器，以短的連續性的片段序列和測序閱讀長度的形式，每周輸出數億以計的堿基的DNA序列。這是一種由DNA連接酶和聚合酶主導化學過程的第二代測序方法，DNA序列將會用生物信息學的方法拼接還原。在成本方面，下一代測序技術比第一代測序技術大體上降低了1000倍，并且還正以指數級的速度下降。目前下一代測序技術已經廣泛應用于全基因組測序，但是在其它基因分析領域，例如特定基因結構突變的檢測等方面尚未得到充分開發。?

基因檢測是利用血液、其他體液或細胞對核酸進行檢測的技術，其通過特定設備對被檢測者核酸分子信息作檢測，分析它所含有的各種基因情況，從而使人們能了解自己的基因信息，判斷身體患有疾病的情況或風險，從而可適應性地選擇疾病治療方案，甚至預防疾病的發生。?

現有的基因突變檢測方法還主要集中于以下3個技術：?

1）PCR突變檢測?

基于PCR片段擴增和凝膠電泳分離的方法，從而分辨出野生型和突變性的差異。其缺點包括：其為單堿基突變類型檢測，不能對mRNA進行定量，不能檢測基因顛換；敏感性低；耗時長，單次只能檢測一個基因突變；不能確定堿基的具體變化；無法進行高通量檢測。?

2）Q-PCR（定量PCR）檢測?

基于熒光和PCR片段擴增來對模板mRNA多少來進行定量。其缺點包括：不能檢測單堿基類型突變；不能檢測基因顛換；只能檢測已知突變；耗時長，單次只能檢測一個基因突變；不能確定堿基的具體變化。?

3）基因芯片技術?

用高精度技術將DNA片段打印在芯片上，然后通過DNA雜交結合特性來確定突變性質。其缺點包括：不能檢測基因顛換；只能檢測已知突變；成本高，通量較小；準確率低，通常需要重復2次以上才能確定結果。?

因此可知，目前在基因檢測技術方面尚缺少更為全面、快速、簡便、準確的檢測方法，特別是在目前擁有下一代測序技術這種以高通量、低成本基因測序為特點的技術的情況下，如何基于下一代測序技術開發新型基因檢測和篩查技術，是本領域研究人員廣泛關注的問題。并且，如果應用下一代測序技術來檢測基因的結構突變情況，如何獲得能夠滿足下一代測序技術要求的基因檢測樣本，也是期待解決的一個技術問題。?

BRAF基因編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等，也是重要致癌基因之一。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌、胰腺癌以及毛細胞性白血病等均存在不同比例的BRAF基因突變，約66%惡性黑色素瘤和15％的結腸癌中BRAF基因存在體細胞突變。黑色素瘤，尤其是已經發生轉移的黑色素瘤，通常預后都很差，一般Ⅳ期的黑色素瘤平均只有8至18個月的生存期。?

大約80-90%的BRAF基因突變發生在exon15的1799核苷酸上，T突變為A，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。V600E突變可模擬T599和S602兩個位點的磷酸化過程，從而使BRAF蛋白異常激活。?

目前標靶藥物達卡巴仁（dabrafenib）單克隆抗體藥物威羅菲尼（Vemurafenib）已經被臨床應用于黑色素瘤，他們能夠特異性地降低黑色素?瘤細胞活化產物的表達，而不影響正常的組織，從而準確殺死腫瘤細胞。?

檢測BRAF基因突變，對判斷腫瘤的發生發展、治療藥物的選擇等方面均有重要意義。?

發明內容