[發明專利]基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法

有效

• 申請號: 201310429041.8
• 申請日: 2013-09-18
• 公開（公告）號: CN103808701A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 張玲;王紅旗;劉繼紅;張軍鋒;周玲;王靜;尹海燕;王建
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法，其

特征在于，包括以下步驟：

（1）赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成；

（2）赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具體操作步驟如下：

（1）赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成

首先將赭曲霉毒素A核酸適配體進行預處理：95℃變性5min，4℃冷卻5min。然后取50μL10mM?Tris-HCl反應緩沖溶液（pH8.5)，其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為50nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為8:10000，室溫反應30min，以使核酸嵌合染料與赭曲霉毒素A核酸適配體充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物；

（2）赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別

往上述步驟（1）反應后的溶液中加入適量的赭曲霉毒素A溶液，用10mM?Tris-HCl反應緩沖液（pH8.5)調整溶液體積為100μL，其中其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為4:10000，室溫反應5-10min，以使赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A復合物，從而導致赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的解離，產生熒光強度的變化。將反應后的溶液放入熒光光譜儀，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，測定其熒光信號強度并記錄熒光強度的變化：空白對照的熒光強度（I₀）最大，隨著OTA濃度的增加熒光強度（I）逐漸減弱。

按上述（1）、（2）步驟對配制的不同濃度赭曲霉毒素A標準液進行檢測，記錄各標準溶液樣品所產生的熒光強度的變化值（ΔI=I₀-I）；用ΔI對標準溶液中赭曲霉毒素A濃度作圖獲得標準曲線，未知樣品中赭曲霉毒素A所產生的熒光強度的變化值與標注曲線對照確定其濃度。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征是：赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，序列為5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’。