[發(fā)明專利]微擬球藻NgAUREO1基因在調(diào)控脂肪酸代謝中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310428941.0
• 申請日: 2013-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN104419711A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭明剛;黃一江;王玲;鄭立;李妍;仝顏麗;趙燕燕;王春;周曉麗
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭明剛;黃一江;王玲
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C07K14/405;C12N15/81;C12R1/89;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及從微擬球藻中克隆了一個(gè)新的編碼區(qū)為1398bp的受藍(lán)光調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因(NgAUREO1)，并證明了該基因在調(diào)節(jié)脂肪酸代謝中的新功能。

二、背景技術(shù)：

隨著當(dāng)今世界能源危機(jī)的日趨嚴(yán)重，人們已經(jīng)逐步把目光從傳統(tǒng)的石油化工燃料，轉(zhuǎn)向生物質(zhì)能源上。然而生物體油脂含量的高低是影響生物質(zhì)能源發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。已經(jīng)有許多科學(xué)家在這一問題上做了大量的研究。有的通過篩選油脂含量相對較高的生物體作為原料，但仍無法滿足生物質(zhì)能源的需求；有的將生物體置于缺氮、低溫等逆境中以促進(jìn)生物體油脂含量的增高，但是這必然導(dǎo)致生物量的降低；還有人提出通過基因工程對生物體進(jìn)行改造，使其可以大量積累油脂，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果多數(shù)不盡人意。究其原因主要是所利用的基因多為調(diào)控單一通路的功能基因，其調(diào)控范圍窄，影響能力弱，從而無法達(dá)到理想的效果。

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用可以激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄。與基因技術(shù)定位于改造單個(gè)基因不同，轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)影響一系列基因的多條代謝路徑，這些代謝路徑在同時(shí)作用下完成正向或者負(fù)向的調(diào)控。目前這一技術(shù)已經(jīng)被證實(shí)可以促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物在植物細(xì)胞中的積累。

Aureochromel于2007年從無隔藻中被發(fā)現(xiàn)，研究表明該基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子功能，可以特異性的結(jié)合TGACGT序列。這一序列是典型的S型或D型bZIP的結(jié)合位點(diǎn)。該基因由一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(bZIP)和一個(gè)感受藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu)域組成。正是由于這一特殊的結(jié)構(gòu)賦予了該轉(zhuǎn)錄因子受藍(lán)光誘導(dǎo)的特性。研究表明，該基因控制著無隔藻的分支發(fā)育活動(dòng)。然而未有研究證明該基因具有其他功能。

我們從微擬球藻(Nannochloropsis?gaditana)中克隆了一個(gè)新的藍(lán)光誘導(dǎo)的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，并命名為NgAUREO1。該基因所編碼的蛋白具有一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合目的基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性序列，以及一個(gè)可以感受波長為470nm的藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu)域。該基因與無隔藻中aureochromel的氨基酸序列相似性為59％。我們構(gòu)建了該基因的酵母表達(dá)載體并將此轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入釀酒酵母中，通過測定酵母脂肪酸的含量，證明了該轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi)油脂含量的增加。我們還通過對轉(zhuǎn)有該基因的釀酒酵母進(jìn)行藍(lán)光照射，并測定脂肪酸含量，證明了藍(lán)光可以控制該轉(zhuǎn)錄因子參與脂肪酸的合成與分解。

三、發(fā)明內(nèi)容：

1、克隆了微擬球藻中的藍(lán)光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NgAUREO1

從本實(shí)驗(yàn)室所建立的微擬球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到aureochromel基因的片段，根據(jù)該片段設(shè)計(jì)了兩對基因特異性引物(5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol?Plant?total?RNA提取試劑盒提取微擬球藻RNA，用TransScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，通過PCR擴(kuò)增得到NgAUREO1基因的全長，連接到pMD19-T載體上，導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，挑選陽性克隆菌株進(jìn)行菌液PCR鑒定。最后將帶有目的基因片段的大腸桿菌送上海生工測序。測序結(jié)果表明該基因的ORF為1398bp；5’端非編碼區(qū)為192bp；3’端非編碼區(qū)為490bp，編碼465個(gè)氨基酸。將測序結(jié)果與無隔藻中aureochromel基因的序列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)微擬球藻中的aureochromel基因編碼的氨基酸序列與無隔藻中相應(yīng)基因編碼的氨基酸序列有59％的同源性。將這個(gè)蛋白序列進(jìn)行BLAST分析，顯示該蛋白的241-300位氨基酸為一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域；341-444位氨基酸為一個(gè)可以感受藍(lán)光的LOV結(jié)構(gòu)域。以上分析說明該基因?yàn)槲M球藻中的一類新的可以感受藍(lán)光的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，命名為NgAUREO1。

2、構(gòu)建了NgA?UREO1基因的酵母表達(dá)載體pYES2-NgAUREO1

設(shè)計(jì)一對帶有HindIII和SacI限制性酶切位點(diǎn)的引物(P1，P2)以微擬球藻cDNA為模板擴(kuò)增NgAUREO1基因，并將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pMD19-T載體上，導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行繁殖。提取質(zhì)粒利用HindlII和SacI限制性酶對pMD19-T和pYES2同時(shí)進(jìn)行雙酶切，分別獲取小片段和大片段，利用T4連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行PCR和酶切鑒定后得到重組質(zhì)粒pYES2-NgAUREOl。

3、證明了該基因可以促進(jìn)脂肪酸積累的新功能